酵母對亞急性瘤胃酸中毒綿羊緩解效果及作用機制研究

韓郭皓，高曉莎，段晉偉，張慧琴，鄭 巖，何金鑫，丁建安，霍乃蕊，裴彩霞，李紅麗，古少鵬*

(1.山西農業大學動物醫學學院，太谷 030801；2.朔州職業技術學院生物工程系，朔州 036002；3.山西農業大學動物科學學院，太谷 030801)

反芻動物養殖中，為達最大生產性能常飼喂大量高精飼糧，高精飼糧在瘤胃內發酵導致酸性有機物大量產生并積累，瘤胃pH長期處于較低水平，引起亞急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis，SARA)。SARA臨床癥狀常不明顯，預防和診斷比較困難，常造成巨大的經濟損失。瘤胃pH是判斷SARA的關鍵指標，瘤胃pH于5.2～5.6持續3 h以上可診斷發生SARA。目前，SARA發生機制包括乳酸中毒學說以及內毒素組胺中毒學說。近年來，許多學者都致力于尋找一種高效、無毒副作用緩解瘤胃酸中毒的方法，如使用包括緩沖劑、電子受體、乳酸菌臨床疫苗和莫能菌素等方法來阻止或緩解瘤胃中毒的發生和發展。但上述方法效果欠佳，在一些大型牧場，SARA仍是當前反芻動物養殖中的主要疾病之一。

酵母在反芻動物飼養中可以起到促進瘤胃發育、促進營養物質消化和吸收、調控瘤胃菌群結構、加強機體免疫力等作用。研究表明，釀酒酵母CNCM I-4407可緩解荷斯坦奶牛SARA，提升瘤胃pH、降低瘤胃液乳酸積累、改善瘤胃菌群。但釀酒酵母CNCM I-1077并未顯著提升高精料飼喂夏洛萊牛的瘤胃pH。不同結果可能與酵母菌種有關，因而尋找具有改善反芻動物瘤胃代謝，且有良好瘤胃內環境適應能力的酵母菌種十分重要。從瘤胃中分離和篩選的酵母具有更適應瘤胃內環境和更易在瘤胃內生長定殖的特點，可作為防治SARA的益生菌菌種，在反芻動物健康養殖中有重要的應用價值。

在本課題組前期研究中，成功分離鑒定并篩選出兩株牛瘤胃源褶皺假絲酵母()，經體外發酵試驗證實具有一定防治反芻動物SARA作用。為進一步闡明瘤胃源酵母對SARA的防治效果，本研究通過對SARA綿羊灌服上述兩株瘤胃源褶皺假絲酵母和1株釀酒酵母，研究3種酵母對瘤胃菌群、瘤胃與血液異常代謝產物和血氣指標影響，進一步探究酵母對SARA綿羊緩解效果及其機制，為研制防治反芻動物SARA微生態制劑提供菌株和理論依據。

1 材料與方法

1.1 酵母

褶皺假絲酵母N07、褶皺假絲酵母N09、釀酒酵母ACCC 21162為本實驗室保存菌種。褶皺假絲酵母N07和褶皺假絲酵母N09的18S rRNA序列信息保存于GenBank，登錄號分別為MW888912和MW888913。酵母液體培養基成分為：紅糖5%、酵母提取物2%、硫酸銨1%、氯化鉀0.2%。菌株接種后，置于39 ℃，180 r·min的蘇州培英THZ-C型恒溫震蕩器中培養24 h，培養后的酵母菌數達到1×10CFU·mL。

1.2 試驗動物與試驗設計

選取60只2月齡同期斷奶、平均體重(20.50±2.21)kg杜泊羊(♂)×湖羊(♀)F代作為試驗動物，公母各半。預飼期30 d，飼喂精粗比50∶50基礎飼糧。通過遞增飼糧精粗比誘導綿羊發生SARA，飼糧精粗比依次為70∶30、80∶20、90∶10和100∶0，各比例飼糧飼喂7 d，第28天確認40只綿羊發生SARA。將40只SARA綿羊隨機分為4組，分別為：SARA模型組(SARA，=10)、釀酒酵母組(SC，=10)、褶皺假絲酵母一組(DR1，=10)和褶皺假絲酵母二組(DR2，=10)，均飼喂精粗比為90∶10飼糧，各酵母組于每日晨飼后分別灌服釀酒酵母ACCC 21162、褶皺假絲酵母N09、褶皺假絲酵母N07培養液100 mL。另設置對照組(CON，=10)，飼喂精粗比50∶50飼糧。試驗設計如圖1所示。每日06:00和17:00飼喂，各飼糧組成見表1。

表1 飼糧組成及營養水平(風干基礎)

圖1 試驗設計

1.3 樣品收集與測定

灌服酵母期第1、3、7天晨飼后3 h以及第10天晨飼后1、2、3、4、5、6、8 h使用科立博A1164K型瘤胃液口腔采樣器抽取瘤胃液，每只50 mL，四層紗布過濾保存。灌服酵母期第10天，晨飼前用BD Preset采血器和含促凝劑的采血管采集頸靜脈血液。

1.4 生物信息與統計分析

各樣本菌群測序數據根據原始序列數據的條形碼序列和PCR擴增引物序列分離得到。使用FLASH 1.2.7獲得高質量的標簽數據。Qiime 1.9.1用于標簽截取和標簽長度過濾。Vsearch 2.8.1用于去除嵌合序列并獲得有效標簽。利用Uparse 7.0.1001基于97%的序列一致性，將這些序列組合成可操作的分類單元(OTUs)。Mothur方法和SILVA 132的SSUrRNA數據庫用于物種注釋分析。使用Qiime 1.9.1和R 2.15.3進行alpha多樣性分析和beta多樣性分析。

使用SPSS 26軟件的單因素方差分析和DUNCAN檢驗法的多重比較進行統計分析，相關性分析采用雙變量Pearson相關分析。<0.05時有顯著差異。數據以“平均值±標準差(Mean±SD)”表示。

2 結 果

2.1 酵母對SARA綿羊瘤胃pH的影響

由表2和表3可知，隨灌服酵母時間延長，灌服酵母組瘤胃pH逐漸升高，第3天(<0.05)和第7天(<0.01)灌服酵母組pH均顯著高于SARA組；第10天測定的7個時間點灌服酵母組pH均極顯著高于SARA組(<0.01)，說明SARA狀態得到有效緩解。

表2 酵母對SARA綿羊瘤胃pH的影響

表3 灌服酵母期第10天瘤胃液pH

2.2 酵母對SARA綿羊瘤胃異常代謝的影響

由表4可知，灌服酵母組第10 天瘤胃液乳酸和組胺含量顯著低于SARA組(<0.05)，DR1組和DR2組瘤胃液組胺含量極顯著低于SARA組(<0.01)，灌服酵母組瘤胃液內毒素較SARA組有所下降，但差異不顯著(>0.05)。

表4 不同酵母對綿羊瘤胃液乳酸、組胺、內毒素的影響

2.3 酵母對SARA綿羊瘤胃菌群的影響

由表5可知，各組間菌群Chao 1指數和Shannon指數差異不顯著(>0.05)，灌服酵母組瘤胃菌群Chao 1指數較SARA組有所提升，其中SC組最高；SC和DR2組Shannon指數較SARA組有所提升，其中DR2組最高。

表5 不同酵母對綿羊瘤胃菌群Alpha多樣性的影響

由圖2可知，門水平下，主要菌門為擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes)。SC組和CON組最優菌門為擬桿菌門，SARA、DR1、DR2組最優菌門為厚壁菌門。與SARA組相比，SC、DR1、DR2組擬桿菌門(55.48%、29.46%、24.95%)相對豐度增加，厚壁菌門(38.69%、63.52%、60.55%)相對豐度減少。

圖2 不同酵母組綿羊瘤胃10個最豐富細菌門(A)和屬(B)的相對豐度

屬水平下，主要菌屬為瘤胃菌科未確定屬(unidentified)、普雷沃氏菌科未確定菌屬(unidentified)、羅氏菌屬()、乳桿菌屬()、毛螺菌科未確定菌屬(unidentified)、解琥珀酸菌屬()。SC組最優菌屬為乳桿菌屬，CON組最優菌屬為普雷沃氏菌科未確定菌屬，SARA、DR1、DR2組最優菌屬為瘤胃菌科未確定屬。與SARA組相比，SC組乳桿菌屬(10.29%)、普雷沃氏菌科未確定菌屬(2.57%)相對豐度升高；羅氏菌屬(5.89%)和瘤胃菌科未確定屬(3.89%)相對豐度降低。與SARA組相比，DR1組乳桿菌屬(7.03%)、羅氏菌屬(9.66%)、普雷沃氏菌科未確定菌屬(2.23%)相對豐度升高；瘤胃菌科未確定屬(24.73%)和解琥珀酸菌屬(1.94%)相對豐度降低。與SARA組相比，DR2組普雷沃氏菌科未確定菌屬(5.41%)相對豐度升高，羅氏菌屬(1.75%)、乳桿菌屬(2.19%)、瘤胃菌科未確定屬(20.42%)相對豐度降低。

由圖3可知，SARA組相對豐度顯著增加(<0.05)，DR1組相對豐度顯著增加(<0.05)。

A.LDA值分布圖；B.分支進化圖

2.4 酵母對SARA綿羊血液代謝的影響

表6 不同酵母對綿羊血氣分析的影響

表7 不同酵母對綿羊血清異常代謝的影響

2.5 瘤胃液、血液和瘤胃菌群主要指標間相關性分析

由圖4可知，瘤胃液pH與血清內毒素、血清組胺呈現顯著負相關(<0.05)，瘤胃液pH與瘤胃液內毒素、瘤胃液組胺、瘤胃液乳酸呈現極顯著負相關(<0.01)，瘤胃液pH與血液實際碳酸氫鹽呈現顯著正相關(<0.05)；瘤胃液乳酸與菌群Chao 1指標呈現顯著負相關(<0.05)，瘤胃液乳酸與血清內毒素、血液乳酸呈現顯著正相關(<0.05)，瘤胃液乳酸與血清組胺、瘤胃液內毒素、瘤胃液組胺呈現極顯著正相關(<0.01)；血液實際碳酸氫鹽與瘤胃液組胺、瘤胃液內毒素、血液乳酸呈現極顯著負相關(<0.01)。

*.P<0.05；**.P<0.01

3 討 論

反芻動物瘤胃內環境和微生物生態體系處于一個動態的平衡狀態。瘤胃pH是最基本、最直接、最重要的生理指標。Alzahal等研究表明，活性釀酒酵母Y1242有助于提升反芻動物瘤胃pH。本研究顯示3株酵母均可有效提升瘤胃pH，與上述研究結果一致。

瘤胃穩定的內環境為微生物活動及繁殖提供了良好的生存條件，瘤胃菌群通過參與瘤胃內營養物質代謝而影響瘤胃代謝。反芻動物長期采食高精料飼糧會導致瘤胃內環境和瘤胃菌群失衡，乳酸菌產生增加，導致瘤胃乳酸產生增多，乳酸積累，引起瘤胃酸中毒。本研究中，3種酵母均顯著降低了瘤胃乳酸積累。相反地，Vyas等在牛飲食中添加活性干酵母并沒有觀察到瘤胃乳酸顯著下降。不同結果可能與酵母菌種及飼糧組成相關。本研究顯示，Chao 1與瘤胃乳酸濃度呈現顯著負相關，瘤胃乳酸積累導致瘤胃內環境長期處于酸性狀態，瘤胃內環境變化引起瘤胃細菌大量死亡，菌群豐富度降低。本研究顯示，3種酵母均有助于維持瘤胃菌群數量，這可能因酵母代謝了瘤胃內異常發酵產生的乳酸，起到了維持瘤胃內環境穩定的作用。本研究顯示，灌服酵母可提升瘤胃菌群豐富度和多樣性，與Cao等的研究結果相似。瘤胃內毒素和瘤胃組胺呈現極顯著正相關，SARA導致瘤胃內大量細菌死亡，死亡后的革蘭陰性菌細胞壁釋放出大量內毒素進入瘤胃，同時促進1種炎癥介質組胺的產生。本研究中的3種酵母均降低了瘤胃組胺和內毒素含量，與Peng等研究一致，提示酵母可通過改善瘤胃內環境緩解酸中毒狀態，減少瘤胃內細菌的死亡。褶皺假絲酵母N07組瘤胃組胺和內毒素含量最低，在減輕瘤胃炎癥方面顯示了優勢。而Diaz等報道在羔羊飼料中添加1種商業活性釀酒酵母后對瘤胃內毒素含量并沒有產生顯著的影響。不同結果可能與動物品種和酵母菌種相關。

本研究中，灌服酵母組瘤胃液和血清內毒素、血清組胺與SARA組差異不顯著，可能與綿羊發生SARA后仍以高精料飼喂、灌服酵母持續時間較短等因素有關。本課題組前期對處于SARA誘導過程的綿羊灌服3株酵母，發現灌服酵母組瘤胃液和血清內毒素均顯著低于SARA組，表明防治綿羊SARA發生應以預防為主，防重于治。

4 結 論

本研究中3株酵母均可通過提升瘤胃菌群豐富度，降低瘤胃液和血液乳酸積累，減輕瘤胃炎癥，提升機體堿儲備，起到緩解綿羊SARA的作用，可為防治反芻動物SARA微生態制劑提供優良菌株和理論依據。