蒙古馬不同耐力運動水平的血漿代謝組特征研究

魏睿元,趙一萍,白東義,韓海格,王希生,阿娜爾,烏英嘎,芒 來*,李旭東

(1.內蒙古農業大學動物科學學院 馬屬動物研究中心 農業農村部馬屬動物遺傳育種與繁殖科學觀測實驗站 內蒙古自治區馬屬動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，呼和浩特 010018；2.北京軍區紅山軍馬場，赤峰 025377)

蒙古馬是經過千年的自然和蒙古族先民選育，塑成具有抵抗嚴寒、耐粗飼、抗病能力強、騎乘速力佳、能持久長途跋涉等特有品性。作為草原上的使者，蒙古馬一直承載著祖輩曾經的輝煌與精神。目前，蒙古馬運動性能方面的研究，主要集中于分子生物學方面。楊麗華對蒙古馬運動相關候選基因在運動前后的表達及蛋白質組進行了分子鑒定，吳蘇日古嘎就蒙古馬運動候選基因的表達及基因多態性進行了分析。對于馬運動代謝組學方面的研究國內尚未見報道。代謝組學是以高通量檢測和大數據深度分析為基礎的系統生物學學科，與常規的某一項或多項指標的檢測方法相比，能更全方位、敏銳的監測機體整體性的生命代謝活動的動態變化。對蒙古馬運動代謝組學的研究，有助于深入了解其在運動過程中機體的生物學變化特征，為指導科學訓練，有效發掘耐力運動的遺傳潛能，保障競賽中人、馬的安全，助力蒙古馬訓育工作提供重要參考。

本研究應用核磁共振(NMR)技術，采集蒙古馬兩次耐力負荷(15、30 km)運動前后的血液樣本，分析血漿代謝譜，結合單變量方差分析和多變量多維分析，鑒別耐力運動前后明顯變化的血液小分子化合物，比較兩次耐力負荷代謝物間的差異，發現潛在的標志性代謝物，以探索耐力負荷下蒙古馬機體代謝通路，為我國耐力型運動馬的訓練及選育工作提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本研究在烏蘭布統鄉的紅山軍馬場5 km專用比賽跑道完成。試驗動物為5歲左右的蒙古馬騸馬6匹，體尺指標基本一致(表1)。6匹馬15 和30 km負荷訓練全程均以快步步法完成，用時控制在相近的范圍內，確保均速一致，以排除體尺因素的影響(表2)。

表1 蒙古馬的基本情況

表2 蒙古馬耐力運動信息表

1.2 血樣采集

對6匹蒙古馬分別進行15 與30 km運動負荷訓練，每匹馬每次采集其運動前晨血液樣本20 mL，運動后再采集血液樣本20 mL，共計24個血液樣本，用肝素鈉抗凝，5 000 r·min低速離心3 min，用移液槍迅速分離出1.5 mL血漿放到凍存管中，立刻投入液氮保存，再轉入-80 ℃冰箱，用于H-NMR代謝組檢測。

1.3 核磁檢測樣品處理

核磁待檢樣本制備：將6個血漿樣本解凍，分別快速渦旋30 s，吸取混勻的血漿萃取上清液800 μL于超濾膜中，13 000 r·min、4 ℃離心30 min，再重復1次，離心15 min；分別各吸取濾液450 μL到離心管，再加入50 μL ACDSS試劑，10 s渦旋使ACDSS試劑與濾液混勻；將混勻的混合濾液，4 ℃ 13 000 r·min離心2 min，分別吸取上清液480 μL到核磁管中，標記編號，用于采集核磁共振圖譜。

1.4 1H-NMR圖譜采集

樣品進行H-NMR 掃描。質譜儀氫質子共振頻率600.13 MHz，檢測溫度298 K，脈沖序列Noesygppr1D，采樣參數：DSS為內標(標準DSS峰的50%高峰寬≤1.2 Hz，11%高峰寬≤15 Hz，5%高峰寬≤30 Hz)，脈沖序列中等待1 s、混合0.1 s，施加50 Hz低功率強度進行水峰連續波抑制，8 kHz譜寬，0.15 s混合，馳豫延遲1 s，采樣點數32 k，65 536頻率域寬(frequency domain size)，時間域寬(time domain size)32 678，FID 64次累加，進行一維NMR譜相位調整，傅立葉變換，基線校正。所有樣本的H-NMR譜都在同一譜儀上獲得。

1.5 數據處理

將NMR自由衰減感應(FID)信號導入軟件Chenomx NMR suit 8.0(edmonton，Canada)中，自動進行譜線校準。用0.0 ppm DSS-d6峰為譜圖化學位移的基準，進行譜圖峰形調整。以DSS-d6的譜峰面積和濃度為標準，通過軟件數據庫對樣本核磁譜圖的檢測信號一一比對解析。采用目標分析法，將分析確認的代謝化合物的類別和濃度數值數據，經過R語言pls包、ggplot2包進行質量歸一化、標準化處理，再進行有監督偏最小二乘判別分析(PLS-DA)模式識別及可視化作圖，以分析觀察組間代謝模式是否有差異，分析結果以得分圖(score plot)的形式表示。以判定模型提取的VIP值(變量重要性投影值)作為對區分分組差異有貢獻的目標代謝物，將VIP>1的代謝物作為感興趣的代謝物，同時使用SPSS20.0軟件(IBM-SPSS公司，芝加哥，美國)進行組間代謝物的One-way ANOVA差異性檢驗。

2 結 果

2.1 蒙古馬不同運動負荷水平的血漿代謝物歸屬

利用加拿大Chenomx公司商用代謝組數據庫，對6匹蒙古馬兩次運動前后血漿NMR圖譜中的代謝物類別及濃度進行歸屬，共歸屬出47種代謝物，如圖1和表3所示。其中，對蒙古馬經過15 km運動負荷前后的血漿代謝物進行分析，共鑒定出21種差異代謝物(表4)；對蒙古馬經過30 km運動負荷前后的血漿代謝物進行分析，共鑒定出10種差異代謝物(表5)。對蒙古馬經過15 和30 km運動負荷后的血漿代謝物進行分析，共鑒定出18種差異代謝物(表6)。蒙古馬在兩次運動負荷前后的差異代謝物類別上存在明顯不同，說明在兩次運動負荷期間蒙古馬代謝存在明顯差異。

表3 蒙古馬血漿代謝物歸屬信息

圖1 蒙古馬15和30 km運動前后血漿代謝物歸屬圖譜

2.2 蒙古馬不同耐力運動水平的血漿PLS-DA模式識別與差異標志代謝物

對蒙古馬15 和30 km耐力運動前后血漿樣本H-NMR數據進行模式識別分析，獲得有監督的偏最小二乘判別(PLS-DA)得分，見圖2、圖3與圖4。PLS-DA模式分析結果顯示，15 和30 km耐力運動前后的樣本能很好地區分開，說明兩次耐力運動訓練對蒙古馬機體的代謝模式均造成了明顯的影響。對PLS-DA模型進行有效性檢驗，發現蒙古馬15 km運動前后血漿代謝物的Q2=0.722 2，30 km運動前后血漿代謝物的Q2=0.760 6，15 和30 km運動后血漿代謝物的Q2=0.731 4，通常Q2>0.4認為可信度較高，說明本研究模型的結果是可信的，且發現蒙古馬兩次運動前、后的血漿代謝物均有明顯的差異。

通常選取VIP>1的差異代謝物作為判別樣本組間差異有較大影響的潛在標志代謝物。從圖2B和表4可以看出，乳酸、葡萄糖、甘油、丙氨酸、丙酮酸、乙醇對區分蒙古馬15 km運動前后血漿代謝差異有較大作用。從圖3B和表5可以看出，葡萄糖、乙醇、甘氨酸、甲醇、谷氨酰胺、賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸、τ-甲基組氨酸、肌酸對區分蒙古馬30 km運動前后血漿代謝差異有較大作用。從圖4B和表6可以看出，乳酸、乙酸、甲醇、丙氨酸、二甲基砜、檸檬酸、丙酮酸對區分蒙古馬15與30 km耐力運動訓練后血漿代謝差異有較大作用。

A.血漿PLS-DA得分圖；B.血漿代謝物VIP圖。MFB.運動前；MFA.運動后。不同顏色表示相應分組樣本的總體95%置信區間范圍。下同

A.血漿PLS-DA得分圖；B.血漿代謝物VIP圖

A.血漿PLS-DA得分圖；B.血漿代謝物VIP圖

2.3 蒙古馬兩次運動前后血漿代謝物差異性比較分析

對兩次負荷運動前后的代謝組數據進行單因素方差分析，鑒別出其他具有潛在差異性的代謝物，以便能夠更全面地闡釋耐力運動對馬匹機體代謝造成的影響。從表4可以看出，蒙古馬經過15 km耐力運動后，血漿中亮氨酸、酪氨酸、異丁酸、纈氨酸、乙酰乙酸、3-羥基異丁酸、O-乙酰肉堿、2-羥基異丁酸、苯丙氨酸極顯著升高(<0.01)，甘露糖顯著下降，蘇氨酸、蛋氨酸、肌酐、甘油、3-甲基-2-氧代戊酸、3-羥基異戊酸顯著升高(<0.05)。從表5可以看出，蒙古馬經過30 km耐力運動后，血漿中乙醇、谷氨酰胺顯著的下降(<0.05)，賴氨酸極顯著下降(<0.01)。從表6可以看出，對15 km與30 km運動后進行比較，蒙古馬血漿中甲醇、3-羥基異戊酸、二甲基砜、N-苯乙酰甘氨酸極顯著升高(<0.01)，異丁酸、丙二酸、丙酮、2-羥基異戊酸、2-羥基異丁酸極顯著下降(<0.01)，馬尿酸鹽顯著升高(<0.05)，泛酸、甜菜堿、賴氨酸顯著下降(<0.05)。

表4 蒙古馬15 km運動前后血漿差異代謝標志物

表5 蒙古馬30 km運動前后血漿差異代謝標志物

表6 蒙古馬15 與30 km運動后血漿差異代謝標志物

3 討 論

通常對運動訓練負荷的監控，常采用生化測試指標、酶類或生理指數等輔助指標。代謝組學質譜技術(NMR、LC、GC、MS等)與常規監測系統相比，能更迅捷、精銳、整體性地描繪出機體生命代謝活動模式的實時變化，質子核磁共振技術手段能夠量化全部小分子化合物，能全面性的檢測機體對內外部刺激的波動反應。在馬運動科學技術中具明顯的技術優勢和實際應用前景。本研究基于NMR代謝組學檢測發現，蒙古馬經過15 km運動負荷前后共鑒定出21種差異代謝物，經過30 km運動負荷前后共鑒定出10種差異代謝物。蒙古馬在兩次運動負荷前后的差異代謝物類別上存在明顯不同，說明在兩次運動負荷期間蒙古馬代謝存在明顯差異。

3.1 蒙古馬無氧供能系統代謝

無氧代謝是劇烈運動時氧供應不足，機體通過三磷酸腺苷-磷酸肌酸(ATP-CP)系統及糖酵解途徑迅速供給能量的代謝過程。肌酸池由肌酸、磷酸肌酸構成，ATP合成中脫水或脫磷酸最終以肌酐形式排出，通常是運動員速度、力量素質的評定指標，大量運動引起尿液、血清肌酐升高，反映了骨骼肌細胞磷酸源釋放及代謝循環加強。機體內主要的糖為葡萄糖和糖原。短時間低強度運動后，糖原持續分解及糖異生增強，使血糖升高，但長時間持續劇烈運動使體內糖原消耗殆盡，肌肉攝取血糖增加，使血糖下降。丙酮酸、檸檬酸是機體糖、脂、氨基酸進行三羧酸循環(TAC)代謝或相互轉換的中間產物。丙酮酸參與清除過氧化氫，在機體持續缺氧時，線粒體氧化速率下降，丙酮酸大量累積，而經糖酵解途徑還原生成乳酸供能，血乳酸值被用作無氧代謝能力的評價指標。研究顯示，短時間大強度訓練和中長跑、馬拉松比賽后血糖水平均下降，乳酸、丙酮酸值均升高，力竭運動后尿液檸檬酸呈下降趨勢。

本研究發現，15 km負荷后蒙古馬血漿中肌酐顯著升高，葡萄糖、乳酸、丙酮酸升高，30 km負荷后蒙古馬血漿中肌酸升高，葡萄糖下降，30 km較15 km負荷后血漿中丙酮酸極顯著升高，檸檬酸、乳酸下降，與曾亞琦等對伊犁馬耐力性能研究中的結果相似。肌酐、肌酸的變化說明兩次耐力負荷中，蒙古馬骨骼肌中的磷酸肌酸均被大量消耗，且30 km負荷期間肌酸重新合成在增強。15 km負荷期間葡萄糖、乳酸、丙酮酸表現出升高的趨勢，說明機體糖酵解系統供能加強。30 km較15 km負荷后丙酮酸升高，檸檬酸、乳酸下降則表明30 km負荷期間蒙古馬有氧代謝過程供能在加強。兩次負荷期間糖原均被大量消耗，提示30 km以上的中長距離耐力運動訓練，可能會造成蒙古馬機體磷酸源及糖代謝能量物質被大量消耗，誘發訓練后疲勞。在長時間的耐力運動后，適當補充糖類和有助于有氧代謝的物質，對緩解蒙古馬機體疲勞，促進恢復會有很大幫助。

3.2 蒙古馬有氧氧化系統代謝

有氧氧化代謝系統是糖、脂、氨基酸在氧元素的參與下分解代謝合成大量ATP，最終排出二氧化碳和水的物質代謝過程，是進行長時間耐力活動的主要供能系統。脂肪組織動員儲存的三酰甘油參與能量供應的重要性，隨運動持續時間延續而升高，隨運動強度加強而下降。本研究中15 km負荷后蒙古馬血漿甘油顯著升高，異丁酸、乙酰乙酸、O-乙酰肉堿、2-羥基異丁酸極顯著升高；30 km較15 km負荷后血漿中丙酮、異丁酸、2-羥基異丁酸極顯著下降，N-苯乙酰甘氨酸極顯著升高，泛酸、甜菜堿顯著下降，這些標志物涉及脂肪分解，脂肪酸有氧代謝、酮體代謝、β-氧化，機體抗氧化、抗疲勞、自由基清除、磷脂合成、細胞修護、滲透壓調節、免疫調節等，研究顯示，混合氧運動后短鏈脂肪酸濃度明顯升高，長時間耐力運動中血酮體增加將改變骨骼肌能量供需，由葡萄糖氧化逐漸過渡至以脂肪氧化供能為主，以節省血糖保持運動能力。中等強度長時間的運動比大強度短時間運動更易發生酮癥。隨運動強度的增加，骨骼肌O-乙酰肉堿含量增加，同時自由肉毒堿含量降低，血漿泛酸、甜菜堿濃度下降。補充泛酸、甜菜堿能降低運動性疲勞，增進耐力，提高運動成績。本研究中代謝物變化表明兩次耐力負荷期間脂肪代謝供能均增加。

本研究發現，15 km負荷期間蒙古馬脂肪酸酮體代謝明顯增強，顯示葡萄糖存量不能滿足需求，而30 km負荷期間脂肪酸酮體代謝下降，有氧氧化供能增加，機體的氧化應激均升高，但30 km負荷造成機體免疫壓力增高。提示短距離耐力賽時，脂肪酸有氧代謝、酮體代謝均參與蒙古馬機體能量供應，酮體代謝對維持機體運動能量的需要至關重要，運動結束可能會出現酮癥。30 km以上的中長耐力賽，脂肪酸主要以有氧代謝方式供應蒙古馬機體能量需求。賽程初始階段，酮體代謝是能量供應模式轉換的過渡階段，隨賽程持續蒙古馬機體逐步適應，脂肪酸有氧代謝能量供給平衡建立，酮體代謝減弱，但異丁酸下降，可能預示機體氧含量逐漸下降，處于一定程度的缺氧狀態。運動后補充O-乙酰肉堿、泛酸、甜菜堿等能促進脂肪酸代謝、抗氧化、免疫調節的物質，或許有助于蒙古馬機體穩態的快速調整，避免代謝性傷病發生。此外，關于2-羥基異丁酸、N-苯乙酰甘氨酸對運動能力影響的研究目前尚少，其作用機理有待進一步深入研究。

3.3 蒙古馬氨基酸代謝

參與馬匹機體生命活動的氨基酸約21種，其中必需氨基酸有：組氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、精氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、色氨酸、纈氨酸、亮氨酸10種，且第1限制性氨基酸為賴氨酸。本研究中15 km負荷后蒙古馬血漿中纈氨酸、丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、3-羥基異丁酸極顯著升高，蘇氨酸、蛋氨酸、3-甲基-2-氧代戊酸、3-羥基異戊酸顯著升高，甘露糖顯著下降；30 km負荷后蒙古馬血漿中纈氨酸、甘氨酸、τ-甲基組氨酸、脯氨酸下降，賴氨酸極顯著下降，谷氨酰胺顯著下降；30 km較15 km負荷后血漿丙氨酸下降，丙二酸顯著升高，3-羥基異戊酸、二甲基砜、賴氨酸極顯著升高，2-羥基異戊酸極顯著下降，與Luck等研究結果相似。這些氨基酸及其代謝衍生物，涉及糖、脂、氨基酸能量代謝、糖異生、丙氨酸-葡萄糖循環，參與機體糖原、磷脂、體蛋白、非必需氨基酸、含氮物質合成，細胞保護，自由基、活性氧簇清除，抗氧化應激，炎癥因子、免疫力、血氨、血乳酸、神經體液調節，脂肪酸氧化、機體發育、組織修復、骨骼肌合成分解，防止組織缺氧，疲勞抵抗密切相關。研究顯示，混合氧運動訓練后尿液甘氨酸水平升高，是人體脂肪組織代謝供能比例上升的標志。長時間耐力運動中，血液中芳香族氨基酸水平升高，谷氨酰胺、丙氨酸、支鏈氨基酸(BCAA)、谷氨酸水平顯著下降，但耐力訓練初期，肌肉中丙氨酸合成增加，血液中濃度升高。蛋白質合成調節因子的3-羥基異戊酸(HMB)，能降低肌肉損傷。骨骼肌收縮蛋白分解產物τ-甲基組氨酸(3-MH)。高強度大負荷訓練后恢復期尿液3-MH排出量先下降再上升，骨骼肌蛋白分解具有延緩性，但骨骼肌運動性損傷，尿液3-MH排出會持續增加。運動訓練中，肝組織蛋白為主的非收縮蛋白分解會增加，而肌肉組織蛋白分解是降低的。運動后恢復期，則以骨骼肌蛋白分解為主，這是引起訓練后延緩性肌肉損傷的原因之一。臨床和運動訓練中血漿谷氨酰胺、3-MH、酪氨酸、脯氨酸羥基化修飾生成的羥脯氨酸常作為監測機體骨骼肌分解代謝和過度訓練監控的重要標志代謝物。此外，在比賽前及運動中，馬拉松、越野滑雪運動員補充BCAA，可明顯提升選手的成績，降低其心理疲勞度，且補充酪氨酸能有效降低運動后血漿乳酸和氨水平，緩解疲勞。本研究中，15 km運動后氨基酸水平趨于升高，而30 km運動后氨基酸水平趨于下降，隨負荷增加蒙古馬機體氨基酸代謝參與供能，由丙氨酸-葡萄糖及糖異生途徑向脂肪酸氧化供能轉變。氨基酸消耗大增，尤其BCAA隨負荷增加被大量消耗，隨之機體氧化應激、免疫壓力不斷升高。3-羥基異戊酸、τ-甲基組氨酸的變化，預示機體蛋白分解有增加的趨勢，30 km負荷更顯著刺激了蒙古馬肌蛋白分解合成的頻率，可能會引起運動后肌肉組織損傷。提示耐力性運動期間，隨負荷持續增加蒙古馬機體氧化應激及免疫壓力相應升高，機體可能會出現運動性疲勞和免疫力下降，肌肉等軟組織急劇分解的趨勢會上升，出現傷病的可能性升高。恢復期補充適當的BCAA、谷氨酰胺及一些必需氨基酸有助于蒙古馬機體快速恢復，對緩解運動性肌損傷至關重要。

3.4 蒙古馬腸道菌群活動

馬是具有發達盲腸消化系統的單胃食草動物。其盲腸功能相似于反芻動物瘤胃。定植于盲腸內的微生物區系參與著馬腸道飼草料的消化、吸收及合成代謝，故消化道中盲腸區系菌群正常代謝活動，對保持馬屬動物自身健康狀態至關重要。腸道菌群處于厭氧環境時，由腸道厭氧菌代謝丙酮酸生成甲酸、乙酸、乙醇。腸道甲烷菌生成的甲烷可被代謝為甲醇，厭氧條件下甲醇亦可被甲烷菌用來合成甲烷。馬及其它草食動物生命活動代謝副產物馬尿酸鹽會隨尿液排出。馬尿酸鹽是苯甲酸在肝細胞Mg2+CoA、ATP的共同作用下，通過肽鍵結合甘氨酸生成的代謝物，脫去甘氨酸可再生成苯甲酸。馬尿酸鹽與腸道微生物代謝密切相關，在能源極其匱乏的狀態時，馬尿酸能抑制骨骼肌利用葡萄糖，促使能源物質優先供應給大腦、神經等最重要的生命活動中，激發機體保護性抑制。

本研究中15 km負荷后蒙古馬血漿中乙醇下降，30 km負荷后蒙古馬血漿中乙醇顯著下降，30 km較15 km負荷后血漿中甲醇極顯著升高，乙酸下降，馬尿酸鹽顯著升高，甲醇下降，表明兩次負荷期間蒙古馬腸道微生物活動受到抑制。隨負荷的增加機體葡萄糖消耗加劇，甲醇升高預示腸道甲烷產出增加，腸道嚴格厭氧的甲烷菌活動更加活躍，機體缺氧的程度在加深。提示耐力運動期間，蒙古馬腸道微生物活動處于抑制狀態。隨耐力負荷增加運動后機體能源物質消耗加劇，缺氧狀態加重，可能會引發腸道脹氣類疾病。運動后補充適當能源類、腸道菌群調節的物質，同時采取緩解機體缺氧狀態的措施，會有助于蒙古馬耐力賽后機體穩態的恢復。

4 結 論

在蒙古馬15 和30 km兩次運動前后血漿代謝物中共發現47種差異代謝物，且兩次運動前后的差異代謝物類別存在明顯不同，表明蒙古馬在兩次運動中的代謝存在明顯差異。蒙古馬15 km耐力運動的供能方式以糖酵解的無氧代謝為主，兼脂肪酸有氧和酮體代謝，而30 km耐力運動的供能方式則以脂肪酸的有氧代謝為主，酮體代謝是能量供應模式轉換的過渡性階段。