利用全基因組選擇信號方法鑒別影響豬肉滴水損失的候選基因

陶 偉，侯黎明，王彬彬，劉 航，李開軍，尹彥鎮，郭 皓，牛培培，張總平，李 強，黃瑞華,4*，李平華,4*

(1.南京農業大學養豬研究所，南京 210095；2.南京農業大學淮安研究院，淮安 223001；3.淮安市淮陰新淮種豬場，淮安 223322；4.江蘇現代農業(生豬)產業體系集成創新中心，南京 210095)

滴水損失(drip loss, DL)是評價豬肌肉品質的重要經濟性狀，它是指在豬只屠宰后，由于肌肉組織的生理狀態發生改變，肌肉束縛水能力下降，肌肉內的水分受到重力作用自然緩慢滲出而造成的重量損失。過高的滴水損失不僅會使肉制品加工行業由于鮮肉重量減少而遭受直接的經濟損失，而且也會影響消費者購買欲望。如何改善豬肉的品質，降低肌肉的滴水損失是養殖行業和肉制品加工行業共同面臨的挑戰。目前，我國受非洲豬瘟疫情影響，國內各個省份之間的豬肉供應從“調豬”向“調肉”的方向改變，這意味著未來豬胴體需經歷長時間的運輸才能到達消費市場，這無疑將對豬胴體滴水損失性狀提出更高的要求。

滴水損失作為肉品質評價系統的重要組成部分，主要由遺傳和環境因素調控。早期一些研究發現，滴水損失為中低等遺傳力數量性狀(h=0.08～0.30)。準確的測定豬肉滴水損失性狀需要對豬進行屠宰，測定代價高，并且受到屠宰工藝、測定方法、測定時間等多種因素影響，因此傳統育種方法很難高效改善滴水損失性狀。通過分子標記輔助選擇和全基因組選擇技術，鑒別影響豬肉滴水損失的主效基因和因果位點，將會加快豬肉滴水損失性狀的遺傳育種進程。

蘇淮豬是在新淮豬基礎上再導入大白豬血統，通過橫交、多世代選育而成，含淮豬血統25%，大白豬血統75%。本課題組前期研究發現，蘇淮豬群體滴水損失性狀存在較大的變異，變異系數達到66.88%。因此，本研究利用蘇淮豬作為試驗群體，鑒別影響豬群體滴水損失變異的關鍵基因。通過對高、低滴水損失組的蘇淮豬群體進行80K SNP芯片分型，利用法和法進行選擇信號檢測，篩選出受到選擇的SNP位點，結合對受選擇的代表性SNP在蘇淮豬全群中的關聯性驗證，并通過對選擇信號周邊基因進行功能注釋與富集分析，以期篩選出受到選擇的且與蘇淮豬滴水損失性狀相關的候選基因和位點，旨在為蘇淮豬肉品質的改善提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗在江蘇省淮安市淮陰種豬場內篩選478頭飼養管理條件和日糧相同、日齡相近((237.95±2.13)d)、體質健康的蘇淮育肥豬, 其中閹公豬290頭，母豬188頭，在淮安市金源肉品中心分4個批次屠宰。屠宰前禁食24 h, 期間保持豬只自由飲水。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集 試驗蘇淮豬擊暈放血后，燙毛，去頭、尾、蹄和內臟(保留板油和腎)，稱量胴體重；剪取豬只右耳組織樣1份·頭，放入盛有75%乙醇的2 mL離心管中，注明耳號，-20 ℃保存；采集左半胴體倒數3～4根肋骨處的背最長肌肌肉樣品200 g左右，注明耳號，用于肌肉滴水損失的測定。

1.2.2 蘇淮豬滴水損失表型的測定 本試驗參考國家農業部標準《NY/T 821—2019豬肌肉品質測定技術規范》，采用吊袋法進行蘇淮豬滴水損失表型的測定，具體方法參考文獻[19]。

1.2.3 根據滴水損失EBV挑選試驗群體 本研究先利用Excel 2019軟件對蘇淮豬全群滴水損失表型數據進行描述性統計。再使用DMU軟件計算478頭蘇淮豬滴水損失的EBV，具體模型：

=+++++

式中，代表滴水損失表型的觀測值；代表性別的固定效應；代表批次的固定效應；代表蘇淮豬屠宰日齡，作為協變量；代表蘇淮豬的胴體重，作為協變量；為個體的加性遺傳效應；為隨機殘差效應。

根據滴水損失EBV將478頭蘇淮豬按照從大到小進行排序，挑選高、低各10%的蘇淮豬個體(N=48)用于后續的芯片分型和選擇信號分析。

利用SPSS軟件對蘇淮豬試驗群體內高、低EBV兩組之間的育種值和滴水損失進行單因素方差分析。

1.2.4 高、低滴水損失蘇淮豬基因型檢測 使用天根生物科技有限公司的基因組DNA提取試劑盒提取蘇淮豬耳組織樣品的DNA，質檢合格后，使用基于Illumina平臺的GeneSeek公司開發的GGP 80K SNP芯片進行檢測，獲得SNP分型數據。原始基因型數據以ped和map文件存儲。接著利用PLINK軟件對SNP進行質量控制。質控標準：剔除非常染色體上的SNP，次等位基因頻率大于0.01，個體的SNP檢出率大于0.9。

1.2.5 基因型數據填充 由于進行分析時需要所有的SNP都分型成功，因此本研究將質控后的芯片數據里部分沒有分型成功的SNP位點進行了填充，本研究對有缺失的基因型數據進行填充時使用的Beagle軟件。

1.2.6 選擇信號檢測 按照Weir和Cockerham的統計方法進行高、低滴水損失蘇淮豬群體間值的計算，利用vcftools軟件計算每個位點的值。接著利用R包qqman進行繪圖，來展示全基因組水平上值的分布。

本研究將低滴水損失的蘇淮豬群體作為試驗群體，使用selscan軟件進行選擇信號的計算。然后將原始的值正態化處理后取絕對值，同時按從大到小的順序進行排序。

根據Wright的研究，若群體值在0～0.05 之間，說明各亞群間不存在分化；若值在0.05～0.15之間，為中度分化；若值在0.15～0.25之間，則為高度分化。合并選擇信號分析結果后，取||值在前5%，且值≥0.15 的SNP位點作為受選擇位點。

1.2.7 候選基因檢測及功能注釋和富集分析 基于豬11.1版本參考基因組(Sscrofa 11.1)的位置信息使用Ensembl在線網站對受選擇的SNP位點上、下游各50 kb的區域進行基因注釋，并使用NCBI和Genecard在線網站查找相關基因的功能。通過KOBAS 3.0在線數據庫對候選基因進行GO和KEGG功能富集分析，分析內容涵蓋了細胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)、生物學過程(biological process)。

1.2.8 影響豬滴水損失的QTL注釋 根據豬11.1版本參考基因組(Sscrofa 11.1)的位置信息，利用在線網站Animal QTL Database下載影響豬滴水損失的全部QTL信息。接著，與選擇信號顯著候選位點進行比對。

1.2.9 受選擇的代表性SNP在蘇淮豬全群中的關聯性驗證 本研究對3個位于候選基因內含子上同時又位于QTL區域內的SNPs位點進行分型，通過一代測序進行全群分型。利用SAS 9.4軟件將共有SNP位點基因型與滴水損失進行關聯性分析，具體模型：

=+++++

式中，代表滴水損失表型的觀測值；代表性別的固定效應；代表批次的固定效應；代表蘇淮豬屠宰日齡，作為協變量；代表蘇淮豬的胴體重，作為協變量；為個體基因型的固定效應；為隨機殘差效應。以<0.05表示差異達到顯著水平，以<0.01表示差異達到極顯著水平。所得結果均以滴水損失表型的“平均數±標準誤”表示。

2 結 果

2.1 蘇淮豬滴水損失表型的變異分析

本研究利用Excel 2019軟件對蘇淮豬群體滴水損失表型數據進行描述性統計后發現,蘇淮豬群體滴水損失均值2.04%，群體內存在較大表型變異，變異系數高達76.45%。

利用SPSS軟件進行單因素方差分析，結果見表1，蘇淮豬試驗群體內高、低EBV兩組之間的育種值和滴水損失差異均極顯著(<0.01)。

表1 蘇淮豬群體內高、低EBV組間滴水損失的比較分析

2.2 分別基于Fst和iHS方法得到的顯著選擇信號

首先分別進行了基于和的選擇信號分析。使用selcsan軟件對質控后的全基因組數據進行分析，共得到48 344個標記的值，取絕對值后使用R語言繪圖，以||值在前5%為閾值線，共有2 417個SNPs位于閾值線之上，這些SNPs主要分布在1、2、4、5、6、7、9、11、13、14、15、18號染色體上，其中||值最大的SNP位點位于13號染色體上，結果如圖1所示。接著，又使用vcftools軟件對質控后的51 705個SNPs進行計算，得到了高、低滴水損失蘇淮豬群體間值，并利用R語言進行繪圖，共有1 597個SNPs的值大于0.15，這些SNPs主要分布在1、2、3、6、7、11、13號染色體上，其中值最大的SNP位點位于11號染色體上，結果如圖2所示。

圖1 低滴水損失蘇淮豬全基因組水平上的|iHS|分布

圖2 高、低滴水損失蘇淮豬組間全基因組水平上SNP的Fst分布

2.3 合并基于Fst和iHS方法得到的顯著選擇信號結果

本研究基于兩種選擇信號的檢測結果，選擇||值在前5%，同時值≥0.15的SNP位點作為達到顯著水平的受選擇位點，共計175個SNPs。由圖3可知，這些SNP位點分布在1、2、3、4、5、6、7、11、12、14、16號染色體上，其中主要分布在1、6、7、11號染色體上。

圖3 達到顯著水平的SNP位點在染色體上的分布

2.4 蘇淮豬基因組顯著選擇信號的候選基因注釋

本研究根據豬11.1版本參考基因組(Sscrofa 11.1)的位置信息，使用Ensembl在線網站對達到顯著水平的SNP位點進行基因注釋，共獲得了73個基因。由于很多基因在豬上的報道和研究不多，本研究利用NCBI和Genecard在線網站查找人類直系同源基因的功能。同時，利用KOBAS 3.0在線數據庫對所有的候選基因進行富集分析。如表2所示，通過富集分析結果發現，部分條目的生物學功能與肌肉發育以及細胞氧化應激有關。

表2 候選基因富集分析結果

如表3所示，對選擇信號進行基因注釋后，發現多個基因功能與肌動蛋白功能相關，如、、和1基因；其次還發現了1L1基因與細胞氧化應激相關。

表3 與滴水損失相關的部分重要候選基因的位置和基因的功能

2.5 蘇淮豬受選擇位點與已報道的QTL的比較結果

本研究對蘇淮豬全基因組選擇信號分析鑒別的175個位點進行影響豬滴水損失的QTL注釋。結果如表4所示，通過注釋發現，共有27個SNPs分別分布在15個QTLs上，這些位點涉及到了13個基因，其中rs80930355、rs340037952位點分別位于與肌動蛋白結合有關的、基因的內含子上，rs320624660位點位于與細胞氧化應激相關的1L1基因的內含子上。

表4 蘇淮豬全基因組選擇信號顯著位點的QTL注釋結果

2.6 蘇淮豬受選擇的代表性SNP與滴水損失的關聯性分析

本研究選擇與已報道的QTL區域重合且位于候選基因上的3個SNPs(rs80930355、rs340037952和rs320624660位點)在蘇淮豬全群進行基因分型。通過蘇淮豬全群滴水損失與3個SNPs關聯分析發現(表5)，rs340037952位點與蘇淮豬群體滴水損失存在顯著關聯(<0.05)，rs320624660位點與蘇淮豬群體滴水損失存在極顯著關聯(<0.01)。其中，對于rs320624660位點而言，AA基因型個體的滴水損失極顯著高于GG基因型個體(<0.01)，AG基因型個體的滴水損失顯著高于GG型個體(<0.05)。而rs80930355位點與滴水損失不存在顯著關聯(>0.05)。

表5 基因型與滴水損失的關聯性分析

3 討 論

3.1 蘇淮豬群體滴水損失變異

蘇淮豬含有75% 的大白豬血統和25% 的淮豬血統，并且在蘇淮豬長期的人工選育過程中會對背膘、日增重進行選擇，因此會間接選擇包括滴水損失在內的肉質性狀。但是由于蘇淮豬基因組包含來自大白豬的基因片段和淮豬的基因片段，這造成了蘇淮豬群體內滴水損失性狀可能會存在較大變異。本研究發現，蘇淮豬滴水損失變異很大，也印證了這一判斷。因此，本研究使用蘇淮豬作為試驗動物，來鑒別影響豬滴水損失變異的候選基因。本研究基于蘇淮豬高密度芯片數據，采用和兩種選擇信號方法合并分析的方式對蘇淮豬進行全基因組檢測，鑒別影響豬滴水損失的關鍵變異位點和基因。

由于肌肉滴水損失表型受眾多且復雜的因素影響，如運輸方式、屠宰前的擊暈方式、環境溫度等都會影響滴水損失表型的測定，這會對試驗帶來一些不可避免的誤差，以至于影響性狀表型的準確性和育種效率，因此本研究控制運輸方式和屠宰前的擊暈方式一致。而且隨著數量遺傳學理論的發展，育種學家借助一定的統計方法將性狀的表型值進行剖分，并從中估計出可以真實遺傳的部分，即育種值。因此，相較于豬早期育種時根據性狀表型值的高低來選擇試驗群體的方法，基于育種值高低選擇試驗群體的方法可以更好地提高育種的準確性和效率。本研究基于EBV選擇高、低滴水損失組各48個個體進行選擇信號檢測。通過研究發現，高、低EBV組蘇淮豬的滴水損失存在極顯著差異，進一步說明了本試驗樣品選擇的可靠性。

3.2 影響豬滴水損失性狀的受選擇基因分析

本研究使用兩種單一的選擇信號方法分別鑒別到了很多受選擇的位點，其中單一選擇信號方法得到的最顯著SNP位點上、下游各50 kb的區域沒有發現與已報道的影響豬滴水損失的QTL區域重合，并且附近區域通過基因富集也沒有發現功能上可能與滴水損失有關的基因。本研究為了避免單個選擇信號檢測出現假陽性，選擇對兩種選擇信號的結果進行合并分析的方法，以此來增加結果的可靠性。合并分析后，共發現了175個達到顯著水平的SNPs，這些顯著SNPs共涉及到73個基因，通過功能富集分析發現，許多基因與肌動蛋白、氧化應激、蛋白質磷酸化以及脂質合成有關。同時在175個顯著SNPs中有27個SNPs位于15個與豬滴水損失相關的QTL上，并且涉及到了、、1L1基因，這些基因在功能上與肌動蛋白結合和細胞氧化應激相關。對上述3個分別位于、、1L1基因內含子上的rs80930355、rs340037952和rs320624660位點在蘇淮豬全群內進行基因分型后，并與滴水損失進行關聯分析。結果發現，rs340037952和rs320624660位點與蘇淮豬群體的滴水損失存在顯著關聯，因此可以做為蘇淮豬滴水損失選育提升的潛在分子標記。另外，發現有2個基因(3K4、3)富集到了MAPK信號通路上，MAPK信號通路是已經報道過的在骨骼肌中產生氧化應激的通路之一。然而結果顯示，富集到的與細胞氧化應激相關的條目以及MAPK信號通路并不顯著，這可能是由于基因數目太少造成的。

動物屠宰后的一系列生理生化反應都會導致肌肉的滴水損失增加。目前，研究表明，肌肉靜電荷、肌肉收縮(肌動蛋白和肌球蛋白相互作用)、蛋白質降解以及鈣蛋白主要原酶系統以及氧化反應等均會引起宰后滴水損失的改變。

鄧婕等和趙海洲等的研究顯示，基因編碼的蛋白是一個 E3 泛素連接酶，它通過泛素-蛋白酶體系統來降解異常折疊蛋白，參與氧化應激及線粒體功能調控等多種途徑，發揮保護功能；Neisch和Fehon以及Maniti等的研究表明，()為細胞膜-細胞骨架連接蛋白，即能參與細胞的生長和信號轉導，又可接受胞外信號，使細胞骨架重排；Lundquist等認為，編碼的蛋白是與血清反應因子(SRF)轉錄因子相關聯的轉錄輔激活子，在發育、形態發生和細胞遷移過程中控制調節細胞骨架基因的表達，SRF-MRTFA復合物活性對Rho-GTPase誘導的細胞球狀肌動蛋白(G-actin)濃度變化作出反應，從而將細胞骨架基因表達與細胞骨架動力學耦合，MRTFA通過RPEL重復序列與G-肌動蛋白結合，調節MRTFA-SRF復合物的活性；Janji等認為，L-質體蛋白是是肌動蛋白絲交聯劑大家族的成員之一，L-質體蛋白的磷酸化將蛋白質從低活性狀態轉換為高活性狀態，磷酸化L-質體蛋白可能作為一個整合的信號控制組裝肌動蛋白細胞骨架和細胞運動的三維空間。因此，這些與肌動蛋白相關的基因可以作為影響滴水損失的候選基因。Westhofen等認為，1L1與細胞抵抗自由基有關，1L1基因敲除后導致對氧化應激更高的敏感性和細胞活力降低；該基因編碼的蛋白功能都與細胞氧化應激相關，而屠宰后肌肉的氧化反應是造成肌肉滴水損失增加的主要因素，因此也可以作為影響蘇淮豬滴水損失的候選基因。

4 結 論

綜上所述，本研究使用與兩種互補的檢測方法在高、低滴水損失蘇淮豬群體中找到175個受選擇的SNPs，并依此鑒定到影響蘇淮豬滴水損失的73個受選擇的基因，通過功能注釋發現，有5個基因是滴水損失的功能候選基因。其中4 個候選基因(、、、1)與肌肉中的肌動蛋白有關；而1L1基因與氧化應激有關。同時，還分別在和1L1基因上鑒定到與蘇淮豬群體的滴水損失存在顯著關聯的位點：rs340037952和rs320624660。上述基因和SNPs的檢測為未來解析豬滴水損失的遺傳機制以及蘇淮豬肉質的持續選育提供了參考依據。