75株蛋雞源沙門菌的MLST分型與耐藥性分析

王 喜，李 珂，李廷翠，嚴紅亞，趙 蓉，常志順，廖 明，孫敏華*，信愛國*

(1.云南省畜牧獸醫科學院養禽與禽病研究所，昆明 650224；2.云南農業大學動物醫學院，昆明 650201；3.廣東省農業科學院動物衛生研究所，廣州 510642)

沙門菌()為腸桿菌科沙門菌屬的革蘭陰性桿狀菌，廣泛分布于自然界，血清型眾多，迄今已鑒定出2 600多種，宿主譜較廣，包括人類在內的所有哺乳動物、鳥類和冷血動物，是重要的人畜共患病原體。各血清型沙門菌均有致病性，一旦養殖場沙門菌病暴發，將會給食品安全、公共衛生以及養殖業帶來嚴重后果，嚴重威脅人類健康和經濟發展，并且隨著抗生素在畜禽養殖業生產中的廣泛使用，在抗生素的壓力下，沙門菌已誘發出多種耐藥機制。目前，圍繞云南蛋雞源沙門菌的耐藥性、毒力基因等基本流行情況的報道較少，本研究對2017年7月至2019年5月間來自云南部分養殖場的發病雞進行沙門菌的分離鑒定、多位點序列分型(multi-locus sequence typing，MLST)、耐藥性以及毒力基因攜帶情況檢測分析，以期掌握云南蛋雞源沙門菌病的基本流行病學情況，為云南地區雞源沙門菌的防控以及凈化工作提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源與質控菌株

用于細菌分離的病料為2017年至2019年間分離自云南昆明、大理、開遠、玉溪、石林、鹽津6個地區8個養殖場的142只發病蛋雞肝組織。質控菌株大腸埃希菌ATCC 25922購自中國微生物菌種保藏中心，腸炎沙門菌BNCC 103307購自北納創聯生物科技公司。

1.2 主要試劑

SS培養基、麥康凱培養基等購自廣東環凱微生物科技有限公司；沙門菌屬診斷血清60種購自寧波天潤生物藥業有限公司。

1.3 沙門菌分離鑒定

無菌挑取病雞肝組織，劃線接種于麥康凱瓊脂培養后，挑取沙門菌疑似菌落轉接于SS瓊脂，并進行革蘭染色鏡檢、生化鑒定。參照Tarabees等建立的方法合成沙門菌屬特異性基因A的引物，PCR擴增鑒定后使用沙門菌屬診斷血清進行血清型鑒定。引物合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，測序均由昆明碩擎生物有限公司完成。

1.4 沙門菌分離株MLST分型

依據MLST官方網站合成沙門菌MLST 分型的7 個管家基因C、A、E、N、A、D和D引物，擴增測序后用DNAstar修正，上傳到MLST 網站獲取等位基因編號，進而確定每個菌株的ST 型別。

1.5 沙門菌分離株藥物敏感性檢測

選取15種臨床常用抗菌藥采用K-B紙片擴散法進行藥物敏感性試驗，以大腸埃希菌ATCC 25922作為質控菌。參照Chuanchuen等的方法選取β-內酰胺類、氨基糖苷類、磺胺類、四環素類和喹諾酮類部分耐藥基因對分離株進行檢測。

1.6 沙門菌分離株毒力基因檢測

依據Tarabees等的研究合成9對沙門菌毒力島、毒力質粒和毒素相關毒力基因引物。

2 結 果

2.1 沙門菌分離鑒定

2.1.1 發病雞臨床癥狀及剖檢情況 發病蛋雞精神倦怠，被毛松亂，食欲不振，排白色或綠色稀糞。剖檢可見肝明顯腫大，呈土黃色或黃褐色，少部分呈銅綠色，且大部分有出血點、出血斑，同時可見灰白色點狀或不規則條紋狀、斑塊狀壞死灶，個別雞只脾腫大，臨床初步判斷為沙門菌感染所致。

2.1.2 分離鑒定結果 細菌培養形態、革蘭染色鏡檢、生化鑒定試驗結果均符合沙門菌特性，從142只病雞肝組織樣品中共分離到疑似沙門菌屬菌株75株。

2.2 分離菌PCR鑒定結果

75株分離菌株均能擴增出A基因，表明這75株菌均為沙門菌，發病雞只肝組織樣品沙門菌平均分離率為52.8%。

2.3 沙門菌分離株血清型鑒定結果

血清型鑒定結果表明，75株沙門菌均屬于D群雞-雛沙門菌。雞白痢沙門菌和雞傷寒沙門菌O抗原相同，且均無H抗原，因此采用MLST分型方法對兩種血清型菌株作進一步分型鑒定。

2.4 沙門菌分離株MLST分型鑒定結果

分離菌株均能擴增出7個管家基因(圖1)，產物測序后上傳MLST網站，所有菌株都得到相應的MLST型別，產生2種ST序列型，包括ST92序列型雞白痢沙門菌21株，占總分離數28.0%(21/75)；ST78序列型雞傷寒沙門菌54株，占比72.0%(54/75)，表明目前云南地區蛋雞源沙門菌優勢流行株為雞傷寒沙門菌。

M.DL 2000 DNA Marker；1～7.thrA、purE、aroC、sucA、hisD、dnaN、hemD基因；8.陰性對照

2.5 沙門菌分離株耐藥性檢測結果

2.5.1 沙門菌分離株藥敏試驗結果 藥敏試驗結果顯示，全部菌株對青霉素、四環素等10種抗生素存在不同的耐藥率，其中對青霉素的耐藥率高達100%(75/75)(圖2A)，表明每株菌至少對一種抗生素耐藥，而對頭孢他啶、妥布霉素、阿米卡星、卡那霉素和左氟沙星5種抗生素均敏感。雞傷寒沙門菌除了對頭孢他啶、妥布霉素等5種抗生素敏感外，對其余10種抗生素均存在不同程度的耐藥率，而雞白痢沙門菌僅對青霉素、阿莫西林、氨芐西林和鏈霉素4種抗生素存在不同程度的耐藥率，對其余11種抗生素均敏感。

A.耐藥率；B.耐藥基因檢出率

2.5.2 兩種血清型沙門菌耐藥譜型及多重耐藥統計 對10 種抗生素存在耐藥率的菌株共產生了7種耐藥譜型，耐藥譜型最多由5種抗生素藥物組成，兩種血清型菌株優勢耐藥譜均為PEN，但雞傷寒沙門菌僅次于優勢耐藥譜的為TET-ENR-DOX-SXT-PEN(12株)，而雞白痢沙門菌則為AMX-PEN-AMP(9株)。耐3 類及以上抗生素藥物為多重耐藥，分離菌株多重耐藥率達28.00%(21/75)，且集中于雞傷寒沙門菌，占該血清型38.89%(21/54)(表1)。

表1 沙門菌耐10種抗生素的耐藥譜

2.5.3 沙門菌分離株耐藥基因檢測結果 耐藥基因檢測結果顯示，A、C和E檢出率均高達 100%(75/75)；、2、A檢出率則分別達8.00%(6/75)、10.67%(8/75)、26.67%(20/75)，但3個基因在兩種血清型沙門菌中的檢出率存在較大差異,如A基因主要集中于雞傷寒沙門菌；、A2、B、3、A1、B和B均未檢出(圖2B)。

2.6 沙門菌分離株毒力基因檢測結果

毒力基因檢測結果顯示，毒力島SPI-2(L)基因及細胞毒素B基因均未檢出，除了毒力質粒B基因的檢出率稍低外，為89.33%(67/75)，其余6種毒力基因SPI-1(A)、SPI-3(C)、SPI-4(A)、SPI-5(B)、C和的檢出率均高達100%(75/75)。

3 討 論

沙門菌給畜禽養殖業造成巨大經濟損失的同時，還嚴重威脅著人類健康。本研究從發病蛋雞中共分離到雞-雛沙門菌75株，MLST分型鑒定出ST92序列型雞白痢沙門菌21株，ST78序列型雞傷寒沙門菌54 株，雞傷寒沙門菌為優勢血清型，Haque等在孟加拉國5個行政區分離到的214株雞源沙門菌中，檢出的優勢血清型同樣為雞傷寒沙門菌，表明該血清型為禽類養殖中重要的病原菌之一。

畜禽養殖中廣泛使用的抗菌藥，雖能有效降低死亡率，但不能消除動物群中的感染，停止用藥后仍會受到感染，造成細菌耐藥性的增加，且抗菌藥可通過食物鏈的傳遞造成人類對多種抗生素的耐藥性增強。本次分離的沙門菌中共存在7種耐藥譜，多重耐藥率較高達28%，且集中于雞傷寒沙門菌，因此在臨床預防和治療過程中應做到科學合理、規范使用抗菌藥物，禁止濫用。耐藥基因作為細菌產生耐藥性的重要機制之一，可經質粒、轉座子或整合子之類可移動性遺傳元件在不同菌株間進行水平傳播，還可垂直傳播，促使菌株產生耐藥性。本次分離菌株攜帶編碼β-內酰胺類相關基因僅檢出，與孫朋浩等的研究相似，均以的檢出率較高，該基因為β-內酰胺類耐藥菌攜帶率最高的耐藥基因。四環素類僅檢出A基因，且集中于雞傷寒沙門菌，Ahmed和Shimamoto發現埃及禽源沙門菌A是主要的四環素類耐藥基因。磺胺類僅檢出2基因，且檢出率遠低于徐耀輝等在不同地區分離的沙門菌的檢出率。所有菌株均檢出喹諾酮類A、C和E基因，卻僅檢出13株菌耐喹諾酮類藥物，表明這13株沙門菌可能在檢出的喹諾酮類A、C和E基因中有個別或全部基因的耐藥決定區發生了基因突變，或者它們還存在其他耐藥基因和耐藥途徑等。

對分離菌株的5個主要毒力島核心蛋白基因檢測結果顯示，全部菌株SPI-2(L)基因未檢出，其余4個基因均檢出；毒力質粒與腸毒素基因檢出率同樣較高，同樣為沙門菌的重要毒力因子；沙門菌細胞致死性腫脹毒素(cytolethal distending toxin, CDT)B基因未檢出，王月等研究發現，毒力基因B主要分布于傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌中，該基因攜帶情況可能與血清型差異、宿主差異等因素有關。本研究中，毒力基因檢出率均較高，預示本次分離菌的致病性可能較強，存在很大的潛在危險性。

4 結 論

2017—2019年云南地區雞源沙門菌主要存在雞傷寒沙門菌和雞白痢沙門菌2種血清型，多重耐藥情況較為嚴重，耐藥基因與毒力基因檢出率較高，雞傷寒沙門菌多重耐藥率、耐藥基因檢出率高于雞白痢沙門菌。