分子生物實驗室室內質量控制失控原因分析

宋然，孟芹

1.湖南省郴州市第一人民醫院檢驗醫學中心，湖南郴州 423000；2.感染性疾病及腫瘤基因診斷技術國家地方聯合工程研究中心，湖南長沙 410000

近年來，以核酸檢測為代表的分子生物學技術取得了長足的進步并在臨床廣泛開展。 由于其具有靈敏度高、特異性強，可縮短檢測窗口期并可檢測病毒變異等特點，成為臨床病原體感染診斷的主要手段[1]。 收集樣本、提取核酸，擴增核酸，檢測產品與結果報告及解釋等均屬于臨床分子生物實驗室中的基本操作。室內質控是分子生物實驗室質量的關鍵部分，為保證每個標本檢測結果的準確性、可靠性，做好質控是每個分子生物實驗室日常工作的核心之一，實驗室在標本檢測前，要確保室內質控在控，當儀器出現項目失控的情況，必須立刻查找失控的原因并進行及時糾正，才能確保當天各項核酸檢測結果的準確性[2-3]。而室內質量控制即實驗室工作人員采取一定的方法和步驟，連續評價該實驗室工作的可靠性程度，旨在監測和控制本室常規工作的精密度，提高本室常規工作中批內、批間樣本檢驗的一致性，以確定測定結果是否可靠、可否發出報告的過程[4]。室內質量控制范圍覆蓋上述順序中的樣本處理、核酸擴增和產物檢測步驟[5]。 施行有效的室內質量控制措施是保證核酸檢測結果準確性和及時性的有效手段。該文通過統計該實驗室2019年1月—2021年9月HBV DNA、HCV RNA檢測項目的室內質控失控數據及糾正措施，探討分子生物實驗室核酸檢測項目的室內質控關鍵點。 現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

核酸擴增儀為Thermofisher，ABI 7500 擴增儀；該儀器由擴增檢測系統（半導體PCR 儀、鹵鎢燈光源、五色濾鏡輪和冷CCD 照相機進行熒光檢測）、應用軟件及配套電腦組成[5]。 試劑為圣湘生物科技股份有限公司的乙型肝炎病毒核酸測定試劑盒、 丙型肝炎核酸檢測試劑盒。使用核酸檢測試劑配套的陰性質控品、陽性質控品，以及北京康徹思坦生物技術有限公司生產的高值、低值定值質控品進行室內質控檢測。該研究使用的分析儀器和試劑、質控品等經過性能驗證后采用到實驗中，并符合該次研究的需要，所有試劑和質控品均在有效期內使用，儀器都經過校準并在正常狀態下實驗，標本及質控品的檢測操作嚴格執行實驗室質量體系文件標準操作規程。

1.2 方法

對該分子生物實驗室2019年1月—2021年9月間HBV DNA、HCV RNA 檢測項目的質控數據進行回顧性分析。按照該實驗室質量控制程序制定Lvey-Jennings（L-J）質控圖框架，每次實驗的質控品檢測結果自動計入實驗室信息系統并繪制質控圖，按照Westgard 多規則質控程序觀察質控結果。 設置質控規則，以12S 為警告規則，13S、22S、R4S 為失控標準。 試劑盒陰性質控品與陽性質控品質控規則參考說明書中規定。如有質控失控情況則及時分析與處理，并詳細填寫室內質控失控報告。 按照失控原因分類，分別統計該實驗室2019年1月—2021年9月的失控結果，數據來源于《檢驗之星》軟件及實驗室的日常記錄表格。

1.3 統計方法

采用SPSS 21.0 統計學軟件對數據進行整理，計數資料采用百分數（%）表示。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基本數據

該實驗室2019年1月—2021年9月HBV DNA、HCV RNA 項目質控品檢測共1 336 次，失控14 次，總失控率為1.05%（14/1 336）。其中人為因素導致失控的比例較高，共10 次，占比71.43%；質控品因素導致失控2 次，占比14.29%；設備因素、環境因素導致的失控各1 次，各占比7.14%。 見表1。

表1 2019年1月—2021年9月室內質控失控原因統計

2.2 失控情況處理

按統計學原理，由隨機誤差引起結果超出±3s 范圍的可能性為0.3%，發生的概率較低。 室內質控品的檢測結果超出±3s 范圍的發生，提示可能存在非隨機誤差或特殊的情況。這種情況產生的原因通常為：儀器、設備誤差，如儀器未按要求進行校準；實驗環境誤差，如溫度、濕度超出范圍；過失誤差，如測量、記錄中產生的過失，手工操作時產生的失誤等。 對失控情況處理不及時，勢必影響臨床診斷和治療工作，造成不良后果。因此，實驗室內質量控制失控情況一旦發生，均對失控信息進行詳細記錄、立即報告小組、科室及質控負責人;當天的該項目檢測報告不可填發；并應盡速查清原因、采取糾正措施并記錄,必要時復測部分甚至全部標本，重新質控合格后方可填發報告。

2.3 室內質控失控原因分析

①對具體檢測過程進行回顧分析失控后，應對該批檢測的全過程進行迅速仔細的回顧，分析有無特殊情況，如電壓波動導致儀器運行不穩、試劑瓶標簽脫落、試劑放置位置不符合要求、質控品瓶蓋松動、復溶過程異常等。 并應檢查使用的移液器是否進行定期校準，移液器量程是否正確（如刻度旋鈕位置發生移動），移液操作過程中是否有液體反沖進入到移液器內部，校準品或試劑有無變更生產廠家批號、接近失效期或超出廠家建議的反復凍融次數，同批次反應管中液體高度是否相等、管中是否有氣泡、沉淀、絮狀物等。就上述所提及的失控因素，需要在回顧分析中著重觀察。采取選擇性復查的方式來分析出現失控原因及其解決方案。為表明上述分析的正確性，需進一步完善失控因素，予以標本一個合理安排，一般應進行復測。 復測時，應包括室內質控品及本批次標本，以便盡量一次找出原因,及時發出患者標本的檢測報告

②原因分析人為因素：檢測人員操作不當導致的質控品檢測結果失控現象共10 次， 占比71.43%（10/14）。其中因為新進人員使用移液器不熟練，檢測孔內質控品回吸導致的加樣量不足3 次，失控率為21.43%（3/14）；操作人員混勻質控品時進行劇烈搖晃而產生氣泡，然后使用移液器吸取質控品導致加樣量不足1 次，失控率為7.14%（1/14）；在加樣時發現提前準備的質控品量不足1次，失控率為7.14%（1/14）；吸取定量標準品的槍頭誤伸入提取試劑導致污染1 次， 失控率為7.14%（1/14）；加PCR 反應液試劑的槍頭觸碰到處理好的核酸物質1 次，失控率為7.14%（1/14）；質控品未充分解凍，儀器吸取到的質控品濃度不均勻3 次，失控率為21.43%（3/14）。 質控品因素：質控品儲存條件不當導致，通常質控品分裝后儲存于-20℃以下，反復凍融次數過多會因溫度變化會導致質控品的變質，檢測結果失控1 次，占比7.14%（1/14）；質控品更換批號導致的失控1 次，占比7.14%（1/14）。 設備因素：移液器未定期校準導致的加樣誤差，引起室內質控失控1 次，占比7.14%（1/14）。

3 討論

醫學檢驗結果的好壞與醫療質量有著密切的聯系，室內質量控制的主要工作為監測及評價本室工作質量，及實驗報告是否發出實施一種檢查手段，其核心內容為檢測與控制及提高常規工作的質量與準確度。并且注重其準確度所發生的變化，以此來增加日常工作中批間的日間標本檢測均相同，無任何差錯[7-8]。 控制標本檢測的精準度為室內控制的目的，同時觀察其精準度發生變化的因素，確保檢測結果的相同性，這便要求檢驗人員在工作中增加自身的工作能力，統一接受系統化、高端的培訓，嚴格遵守質控規章制度等；在儀器使用方面，需定期檢查儀器并且對其進行校準，實驗室依照實際情況來制訂選擇定值質控物和非定值質控物，對此，嚴格要求質控物與患者標本的檢查需在同一條件，同一溫度下執行，遵守質控物檢查制度予以保存，同時及時在保質期內使用，且對質控結果予以合理有效的分析[9-10]。 就此而言室內質控失控的因素為多種，但是均要經過不斷的實驗來對質控中每個環節，進行細致的觀察，記錄，調整等，明確每個儀器與試劑的使用，才可在質控工作中大幅度降低失誤率，在短時間內找出失控因素且予以相對應的糾正，確保檢測結果的準確性[11-12]。分子生物實驗室需要建立一套全面的質量管理體系，以期獲得及時、準確的檢測結果。 室內質量控制的實施涉及到實驗室的每個人、每個工作環節，是保證日常檢驗質量必不可少的措施。 該實驗室數據顯示，室內質控失控的原因通常為人為因素、試劑因素、設備因素和環境因素等。 實驗室應保證室內質控品的檢測結果在控，出現失控時應及時查找原因并糾正失控，及時分析失控原因對實驗室內質量改進工作具有重要意義。

該實驗室失控原因中人為因素占較大比例，應加強操作人員的專業培訓與考核工作。要求操作人員熟練掌握實驗操作、質量控制等一系列程序，具備生物安全防護意識及防污染意識，嚴格按照實驗室操作規范進行操作與記錄。所有標本處理、核酸提取、核酸擴增設備均應按照實驗室相關規則以及操作規程進行操作。

質控品參與核酸提取與擴增過程，是核酸檢測質量控制的關鍵手段之一。質控品一般由含有檢測靶標的陽性質控與不含有檢測靶標的陰性質控組成[13]，質控品的檢測與標本檢測同時進行。除試劑盒中含有的陽性對照品與陰性對照品作為批內檢測質控品外，實驗室應采購或制備室內質控品用以監測批間檢測差異。質控品在使用過程中，應注意保存、反復凍融等條件，使用前應充分混勻。另外，試劑質量是影響核酸檢測質量的重要因素，而試劑盒質量受原料、生產、包裝、運輸和貯存等條件影響較大，應嚴格按照試劑說明書使用和貯存。

實驗室設備應按期進行維護、校準和性能驗證，做好設備使用及檢查記錄，保證設備處于良好運行狀態。另外，設備應定期進行清潔，防止陽性標準品或陽性標本污染設備導致出現假陽性結果[14]。 操作人員一旦發現質控數據有異常情況，一定要及時進行回顧性分析，初步估計失控原因，然后檢查試劑及質控品的批號，逐步進行排除[15-16]。盡量避免人為誤差，重視對儀器的日常維護也尤為重要。 并且室內質控是檢驗質量的重要保證，要從每一次的失控中總結經驗，吸取教訓，進一步提高檢驗質量[17-18]。

規范的實驗室是保證檢測工作順利進行的前提。實驗室應按照試劑配制、核酸提取、擴增等環節嚴格分區管理，規范場地和設備的布局[19]；制定實驗室操作、清潔、消毒操作規范與記錄文件；保持良好通風條件，避免出現陽性標本、氣溶膠、產物污染等因素導致的核酸檢測假陽性。

臨床實驗室要獲得可靠的測定結果，需要建立一個全面的質量管理體系。在全面質量管理體系中，實驗室質量控制是一個重要的環節，對各實驗室質量控制情況，不斷進行質量改進，才能達到理想的質量控制結果[20]。

綜上所述，分子生物實驗室室內質量控制應體現在核酸檢測的每一個具體環節中，保證各個環節的有效運行，才能完善室內質量控制工作，充分發揮核酸檢測技術優勢的同時保證核酸檢測結果的及時性、準確性和有效性。