免疫組織化學檢測p63、α-SMA對乳腺癌的臨床診斷價值

邸 靜，王 力

商洛國際醫學中心醫院病理科，陜西商洛 726000

乳腺癌是女性常見的婦科腫瘤之一，在過去的50年乳腺癌的發病率逐年升高，已占據女性惡性腫瘤發病率的31%，死亡率排列第三，僅次于胃癌及肺癌，已經嚴重威脅患者生命安全[1]。在乳腺癌的早期診斷中，病理學證據具有關鍵作用。乳腺導管是乳房重要組織成分之一，肌上皮細胞主要分布在乳腺導管外層，與肌細胞作用相似，具有收縮潛能。α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)由377個氨基酸殘基組成，是細胞中6種肌動蛋白之一，也是肌上皮細胞中表達的一種細胞骨架蛋白。肌上皮細胞在乳腺良性病變中可以被檢測到，但是當發生乳腺惡性上皮病變時幾乎找不到肌上皮細胞，因此肌上皮細胞是否存在是區別乳腺良性病變和惡性病變的重要依據[2]。a-SMA屬于肌纖維母細胞的標志蛋白，能夠參與細胞增殖、遷移等運動。肌纖維母細胞是腫瘤間質的重要組成部分，可參與乳腺癌疾病的發生、發展。p63基因是1997年被發現的一種新基因，因與p53具有較強的同源性而被認為是p53家族的新成員。p63蛋白可激活p53相關基因而誘發細胞凋亡，故被稱為腫瘤抑制基因[3]。相關研究顯示，病理學標志物能夠明顯提高乳腺癌疾病診斷效能，其表達水平在一定程度上對患者預后有較高的預測價值[4]。本研究收集2017年1月至2019年5月在本院行乳腺癌根治術的80例患者腫瘤組織及癌旁組織，觀察p63、SMA表達對乳腺癌診斷及預后的影響，以期為乳腺癌病理診斷提供新的指標。

1 資料與方法

1.1一般資料 80例乳腺癌組織及癌旁組織標本均來自2017年1月至2019年5月在本院行乳腺癌根治術的患者。所有組織標本經10%的甲醛固定包埋處理。所有患者均為女性，術前均未進行化療，平均年齡(56.42±11.23)歲，均為單側癌。組織病理學檢查顯示：浸潤性導管癌68例，黏液腺癌7例，乳腺導管原位癌(DCIS) 3例，實性乳頭狀癌2例；組織學分級Ⅰ級36例，Ⅱ級44例；有淋巴結轉移28例，無淋巴結轉移52例。納入標準：(1)接受手術治療的原發性乳腺癌；(2)非雙側病灶；(3)初次手術；(4)可進行隨訪。排出標準：(1)繼發性乳腺癌患者；(2)非單側病灶患者；(3)放化療及免疫治療者；(5)無法進行隨訪者；(6)臨床資料不齊全者；(7)參與其他臨床項目研究者。本研究已經獲得患者同意，簽署知情同意書，并經本院倫理委員會批準同意。

1.2主要試劑 小鼠抗人p63單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，α-SMA抗體購自圣克魯斯生物技術(上海)有限公司，SP9002免疫組織化學(免疫組化)試劑購自中國上海鼎杰生物技術有限公司。

1.3方法

1.3.1免疫組化檢測 將乳腺癌組織及癌旁組織剪切成小塊，脫水、包埋后，采用10%甲醛固定，水化后，37.5 ℃靜置0.5 h后，加入1%的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，山羊血清封閉。加入1抗(1∶500)，加入α-SMA及p63抗體，加入二抗0.5 h后，復染，封閉。選擇不交叉的10個視野，以淡黃色至棕褐色為陽性，計算陽性率。判斷標準：蘇木精-伊紅(HE)染色，染色結果經過本科室2位高年資醫師復診，參考世界衛生組織(WHO)乳腺癌分類形態學(2019年第5版)[5]判定。免疫組化結果判斷參考表1。

表1 免疫組化判斷標準

1.3.2隨訪 對80例患者進行2年時間的隨訪，隨訪方式為電話隨訪及門診復查，隨訪截止日期為2021年5月31日，觀察患者2年生存率。

1.4統計學處理 采用SPSS23.0軟件進行數據分析，計數資料以n(%)表示，采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，采用Log-rank檢驗比較生存率，采用受試者工作特征(ROC)曲線分析診斷價值。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1兩組患者乳腺癌組織及癌旁組織p63、α-SMA陽性表達情況 免疫組化結果顯示，p63、α-SMA陽性表達呈棕黃色顆粒，乳腺癌組織p63陽性表達率低于癌旁組織，α-SMA陽性表達率高于癌旁組織，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2及圖1。

表2 乳腺癌組織及癌旁組織p63及α-SMA陽性表達率比較[n(%)]

圖1 乳腺癌組織及癌旁組織中p63及α-SMA陽性表達情況(×200)

2.2不同臨床特征乳腺癌患者p63及α-SMA陽性情況比較 不同年齡、腫瘤大小、TNM分期及組織學類型乳腺癌患者p63及α-SMA陽性表達率比較，差異無統計學意義(P>0.05)，有淋巴結轉移與無淋巴結轉移乳腺癌患者p63及α-SMA陽性表達率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同臨床特征乳腺癌患者p63及α-SMA陽性情況比較[n(%)]

2.3乳腺癌患者預后分析 80例乳腺癌患者2年生存率為59例(73.75%)，p63陽性患者2年生存人數為13例，存活率為92.85%(13/14)，p63陰性患者2年生存人數為46例，生存率為69.70%(46/66)，Log-rank檢驗顯示，p63陽性與陰性患者生存率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；α-SMA陽性患者2年生存人數為54例，生存率為72.97%(54/74)，α-SMA陰性患者生存人數為5例，生存率為83.33%(5/6)，Log-rank檢驗α-SMA陽性與陰性患者生存率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 預后分析

2.4p63及α-SMA對乳腺癌的診斷價值 p63檢測乳腺癌的AUC為0.778(95%CI：0.683～0.871)，靈敏度為78.54%，特異度為75.16%；α-SMA檢測AUC為0.731(95%CI：0.622～0.838)，靈敏度為76.30%，特異度為70.82%；p63聯合α-SMA檢測AUC為0.872(95%CI：0.794～0.951)，靈敏度為82.46%，特異度為78.17%。p63、α-SMA及二者聯合檢測對乳腺癌診斷均有一定價值。見圖3。

圖3 p63、α-SMA及聯合檢測對乳腺癌的診斷價值

3 討 論

因乳腺癌早期無明顯癥狀，故多數患者確診時已經為中晚期，嚴重影響患者生存預后，因此早期診斷對提高乳腺癌患者預后具有重要意義[5]。本研究結果顯示，p63在乳腺癌組織中的陽性表達低于癌旁組織，α-SMA在乳腺癌組織中陽性表達高于癌旁組織，p63及α-SMA表達陽性水平與患者淋巴結轉移相關，與患者年齡、腫瘤大小、TNM分期及病理組織類型均無相關性，說明p63及α-SMA表達水平參與乳腺癌的發生、發展。

p63屬于p53家族成員之一，主要在正常乳腺肌上皮細胞核中特異性表達。近年研究發現，p63能夠應用于乳腺癌的診斷，效果較理想[6]。侍朋舉等[7]研究顯示，p63在正常肌組織及乳腺良性疾病中的肌上皮細胞中呈陽性表達，而p63在乳腺癌中呈陰性表達，提示肌上皮細胞較少甚至消失。苗洋洋等[8]研究發現，在乳腺癌患者中p63幾乎無表達，但是在無淋巴結轉移的乳腺癌患者癌組織中p63的陽性表達率高于有淋巴結轉移乳腺癌患者，說明p63缺失與乳腺癌發展及轉移有關。α-SMA是肌上皮細胞中表達的一種細胞骨架蛋白，具有較高的平滑肌特異性，可作為良性腫瘤與惡性腫瘤鑒別的指標。有研究顯示，正常乳腺細胞α-SMA表達較少甚至無表達，在乳腺癌組織中α-SMA呈強陽性表達，說明其活性升高能夠促進乳腺癌發生、發展[9]。張哲珺等[10]研究顯示，肌成纖維細胞能夠分泌大量胰島素生長因子及α-SMA，從而加快乳腺癌細胞淋巴結轉移，增加乳腺癌患者復發風險，預后較差。

p63及α-SMA均對肌上皮細胞檢測具有較高的靈敏度，可以用于乳腺癌臨床診斷。但是相關研究證實，乳腺癌患者采用單一p63或單一α-SMA進行檢測的檢出率一般，尤其是對乳腺癌上皮細胞增生活躍時，診斷難度加大，在同一標本組織采用免疫組化檢測p63及α-SMA，能夠更好鑒別乳腺良惡性疾病，避免誤診或漏診[11-12]。

本研究結果顯示，p63陽性與陰性患者生存率比較，差異有統計學意義(P<0.05)，而α-SMA陽性與陰性患者生存率比較，差異無統計學意義(P>0.05)，p63、α-SMA及二者聯合檢測對乳腺癌診斷均有一定價值。α-SMA水平與患者預后相關性較小的原因可能與樣本量較小及隨訪時間較短等因素有關，在后期研究中考慮將增加樣本量、延長隨訪時間。

綜上所述，免疫組化檢測p63、α-SMA表達與乳腺癌患者淋巴結轉移相關，p63表達與患者2年預后存在相關性，p63、α-SMA及二者聯合檢測均對乳腺癌有一定診斷價值。