金素麗，秘玉靜，趙 帥，馬利鋒，沈 莉，閆國超，武 艷△

1.河北醫科大學第一醫院檢驗中心，河北石家莊 050030；2.河北醫科大學第二醫院普外八科，河北石家莊 050004

膽囊結石是臨床上常見的一種疾病。目前，尚缺乏全國性膽囊結石的流行病學資料。有研究報道，我國膽囊結石的患病率為2.3%～6.5%[1]，個別地區的發病率甚至可達24.0%[2]，且隨著人口年齡的增長和人們生活水平的提高，其發病率呈上升趨勢。有研究表明，很多因素可以促進膽囊結石產生，如遺傳因素、環境、性別、脂質代謝異常、膽囊功能、生活習慣、其他疾病影響等[3-4]，這些危險因素可以通過影響膽汁代謝導致膽汁成分改變或影響膽囊功能而誘發膽囊結石[5-6]。雖然目前對膽囊結石形成的危險因素已有所認識，但仍缺乏預防膽囊結石形成的有效策略[7]。膽汁酸是膽囊結石發病的重要因子，人體血清中膽汁酸各亞組分的水平變化與膽囊結石的發病及轉歸關系密切，臨床上常用熊脫氧膽酸作為膽囊結石的治療藥物[1]。因此，膽汁酸的檢測對膽囊結石的診斷及預防價值較大。以往由于技術的限制，臨床上主要測定總膽汁酸水平，不能定量檢測血清中不同膽汁酸代謝組分的變化。隨著超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)技術的應用，膽汁酸代謝譜的檢測在臨床上的應用日漸成熟，利用其高通量的特點檢測血清中膽汁酸的亞組分水平及比例，實現疾病的預防與診斷成為篩選疾病轉化標志物的一種新思路。本研究通過對膽囊結石患者血清膽汁酸譜的檢測，探索膽囊結石的成石原因，以期為臨床診斷及早期預防膽囊結石的發生提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年9月至2020年6月在河北醫科大學第一醫院(下稱本院)確診為膽囊結石的患者48例作為膽囊結石組。其中男16 例，女32 例；年齡27～75 歲，平均(54.08±12.68) 歲。納入標準：(1)經超聲、CT或磁共振胰膽管成像(MRCP)診斷確診為膽囊結石；(2)同意進行血清膽汁酸譜檢測。排除標準： (1)有病毒性肝炎、酒精性肝病等肝臟損傷的病史；(2)有梗阻性膽管疾病，如結石、腫瘤等引起的膽管梗阻。48例膽囊結石患者中，總膽汁酸處于參考范圍內患者32例(總膽汁酸正常組)，總膽汁酸高于參考范圍16例。對照組來自同期本院體檢中心經彩超確認無膽囊結石的健康人群26例。其中男10例，女16例；年齡32～76歲，平均(48.35±11.33)歲。膽囊結石組與對照組性別、年齡比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經本院倫理委員會審批同意，所有受試者知曉并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 儀器：Waters ACQUITY UPLC Ⅰ-Class/Xevo TQD超高效液相色譜系統(美國Waters公司)；H1650R臺式高速冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；G560E渦旋混合器(美國Scientific Industries公司)；CV100-DNA-H真空離心濃縮儀(北京乾明基因技術有限公司)；UPLCBEH C18色譜柱(美國Waters公司，100.0 mm×2.1 mm，1.7 μm)。試劑：超高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS)級甲醇、甲酸、乙腈購自美國Fisher Scientific公司；釋放劑及內標液購自杭州佰辰公司；所有實驗用水均為屈臣氏蒸餾水。

1.3方法

1.3.1樣本的采集及預處理 (1)樣本采集：膽囊結石組(術前)及對照組人員于清晨空腹采集靜脈血5 mL并3 000 r/min 離心10 min，提取上清液保存于-80 ℃冰箱待測。(2)預處理：取100 μL血清樣本，加入300 μL膽汁酸內標工作液，旋渦混合 5 min，12 000 r/min、4 ℃低溫離心5 min，吸取上清液300 μL，低溫濃縮2 h至近干；用100 μL的樣本釋放劑B液復溶，旋渦混合5 min，12 000 r/min、4 ℃低溫離心5 min，取上清液80 μL于96孔板中，采用UPLC-MS/MS對膽汁酸進行分析。

1.3.2UPLC-MS/MS 分析 (1)采用線性梯度洗脫模式對膽汁酸進行色譜分離，流速為0.4 mL/min，柱溫為45 ℃。流動相A為10% (體積比)的甲酸水溶液，動相B為乙腈∶甲醇(3∶1)的混合溶劑。梯度分離條件為：起始38%的流動相B維持0.5 min，至1.9 min升到48% B，第6.7 min 升到64% B，8.7 min 升到83% B，10.7 min 升到95% B，11.3 min降至起始梯度并平衡至12 min。進樣量為5 μL。(2)質譜儀采用電噴霧離子源(ESI)負離子模式進行離子化。采用多反應監測(MRM) 模式對膽汁酸譜進行定量檢測。

2 結 果

15種膽汁酸亞組分[膽酸(CA)、鵝脫氧膽酸(CDCA)、脫氧膽酸(DCA)、石膽酸(LCA)、甘氨膽酸(GCA)、甘氨熊脫氧膽酸(GUDCA)、甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)、甘氨脫氧膽酸(GDCA)、牛磺膽酸(TCA)、牛磺脫氧膽酸(TDCA)、牛磺熊脫氧膽酸(GUDCA)、牛磺鵝脫氧膽酸(TCDCA)、牛磺石膽酸(TLCA)、甘氨石膽酸(GLCA)、熊脫氧膽酸(UDCA)]中，膽囊結石組的GCA、GCDCA、GUDCA、TCA、TUDCA、TCDCA水平高于對照組(P<0.05)；兩組其余膽汁酸亞組分差異無統計學意義(P>0.05)。總膽汁酸正常組與對照組比較，總膽汁酸正常組DCA、UDCA比對照組低(P<0.05)，GUDCA、TCA比對照組高(P<0.05)，其余膽汁酸亞組分差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組膽汁酸譜的比較[M(P25,P75)，nmol/L]

3 討 論

膽囊結石是臨床上的一種多見病、常發病。多數患者并無明顯癥狀，常于健康體檢或其他疾病檢查時發現。但是結石的存在會對膽囊的正常結構和功能產生影響，如占位性影響膽囊排空功能、結石嵌頓引起膽絞痛、結石反復摩擦膽囊壁誘發膽囊炎等[1]。目前膽囊結石的診斷和治療已相對成熟，但術后發生其他疾病的風險也增大。有研究表明，膽囊結石、膽囊切除術可以增加大腸癌發生的危險性[8-9]。此外，膽囊結石術后結石復發率較高，約為20%[10-11]。因此，對膽囊結石形成的原因及預防的研究顯得尤為重要。

膽汁酸是膽固醇的代謝產物，占人體總膽汁的50%～70%。膽汁酸成分的改變是膽囊結石形成的主要原因之一。在非疾病狀態下，血清中膽汁酸各亞組分水平及比例基本穩定，其中CA約占總膽汁酸的40%，CDCA占40%，DCA占 18%，LCA 不足2%。在疾病狀態下，受肝細胞功能和膽汁酸肝腸循環的影響，血清中膽汁酸各亞型的種類及含量可能發生改變，以致膽固醇不能維持微膠粒狀態而析出，最終導致結石的形成。

本研究結果發現，膽囊結石組GCA、GCDCA、GUDCA、TCA、TUDCA及TCDCA 6種膽汁酸亞組分水平比對照組高，差異均有統計學意義(P<0.05)。原因可能是由于膽囊結石患者體內結石大小、數量或部位不同導致部分患者膽汁淤滯，而使血清中的總膽汁酸升高。為排除膽囊結石組部分病例由于總膽汁酸升高而導致統計結果的偏差，作者對膽囊結石組中總膽汁酸處于正常參考范圍內的病例與對照組進行比較，結果發現總膽汁酸正常組DCA、UDCA水平比對照組低，而GUDCA、TCA比對照組高(P<0.05)。由此推斷，可能由于某種機制的作用，膽囊結石患者體內轉化為DCA、UDCA的膽汁酸減少，而增加了GUDCA、TCA的轉化生成，最終導致體內膽汁酸亞組分比例發生變化。

本研究與陳則旭[12]的相關報道存在異同。其相同之處在于，均發現膽囊結石組的GUDCA、TCA比對照組升高，UDCA比對照組下降；不同之處在于，陳則旭等[12]研究認為，膽囊結石組GCA和TCDCA比對照組升高。這可能因為本研究中未排除總膽汁酸升高因素。本研究結果提示，不論總膽汁酸升高與否，膽囊結石患者體內GUDCA和TCA水平比健康人高。另有研究認為，膽汁酸各亞組分在膽石癥發生前，即超聲、CT等結果正常時已有明顯的改變[11]。

綜上所述，GUDCA和TCA可能為膽囊結石診斷和預防的重要標志物，但限于本研究的樣本量較少，后續還需要進行大樣本的研究。