血漿外泌體A1BG-AS1對(duì)原發(fā)性肝癌診斷及預(yù)后評(píng)估價(jià)值*

曾雅莉，唐 靜

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院檢驗(yàn)科,湖北武漢 430077

原發(fā)性肝癌(PHC)是臨床常見的惡性腫瘤，主要發(fā)生在肝細(xì)胞或膽管細(xì)胞，其主要病理類型為肝細(xì)胞癌(HCC)，其患病率在我國(guó)惡性腫瘤位列第四位，死亡率居第三位，嚴(yán)重威脅患者生命健康[1]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)可參與肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程，外泌體是直徑40～100 nm的小囊泡，內(nèi)含蛋白質(zhì)、miRNA、lncRNA等，可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，其中外泌體lncRNA可參與基因調(diào)控、細(xì)胞增殖等，同時(shí)也參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展[2]。郭靜等[3]研究表明，高表達(dá)lncRNA H19的外泌體可明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。A1BG反義RNA 1(A1BG-AS1)為lncRNA的一種，已有研究顯示，A1BG-AS1在HCC組織明顯低表達(dá)，與微血管侵犯、腫瘤分級(jí)高、腫瘤分期晚期和患者預(yù)后不良有關(guān)，過表達(dá)A1BG-AS1可明顯抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲[4]。但是關(guān)于A1BG-AS1在肝癌患者血漿外泌體中表達(dá)及意義的報(bào)道較少。本研究通過檢測(cè)PHC患者血漿外泌體A1BG-AS1水平變化，探討A1BG-AS1與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年12月至2018年6月在本院進(jìn)行治療的75例PHC患者作為PHC組。其中男43例，女32例；年齡37～73歲，平均(55.60±8.70)歲。收集PHC患者腫瘤大小、腫瘤分期、肝功能分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝硬化及甲胎蛋白(AFP)水平等臨床病理特征資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《原發(fā)性肝癌診治規(guī)范(2011)》標(biāo)準(zhǔn)[5]；(2)病理診斷為HCC；(3)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤或轉(zhuǎn)移性肝癌；(2)合并心、肺、腎等嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病；(3)失訪及未按規(guī)定定期隨訪。選取單純肝硬化患者26例作為肝硬化組，均符合肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，其中男15例，女11例；年齡37～75歲，平均(56.4±8.90)歲。選取50例同期體檢健康者作為對(duì)照組，其中男29例，女21例；年齡38～76歲，平均(56.1±8.50)歲。各組性別、年齡等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬均知情同意，并自愿簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 ExoQuick exosome提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)System Biosciences公司，熱休克蛋白70(HSP70)抗體和CD63抗體購(gòu)自Abcam公司，RNA提取試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green PCR Master Mix Kit購(gòu)自TaKaRa公司；JEM-2100透射電子顯微鏡購(gòu)自日本電子株式會(huì)社，ABI 7500熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3方法

1.3.1血漿外泌體提取與鑒定 所有入組人員抽取靜脈血6 mL，裝入含乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管后，3 000 r/min，離心10 min，收集血漿，使用ExoQuick exosome提取試劑盒提取外泌體，使用2%磷鎢酸染色后用透射電子顯微觀察，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白HSP70和CD63表達(dá)。

1.3.2血漿外泌體A1BG-AS1檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)血漿外泌體A1BG-AS1相對(duì)表達(dá)量。RNA提取試劑盒(Thermo Fisher Scientific)提取血清外泌體總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA后，使用SYBR Green PCR Master Mix Kit(TaKaRa)進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。A1BG-AS1上游引物序列為5′-CTTACTGGGCAGCATTG-3′，下游引物序列為5′-GAACATGTCTGCGTATCTC-3′；GAPDH上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算血漿外泌體A1BG-AS1相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3隨訪 PHC患者治療后，對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪，統(tǒng)計(jì)患者生存情況，隨訪日期截至2021年6月30日，總隨訪時(shí)間為36個(gè)月，所有患者完成隨訪，隨訪率為100%。

2 結(jié) 果

2.1血漿外泌體的鑒定 透射電鏡觀察提取的血漿外泌體，可見30～100 nm大小圓形或橢圓形囊泡，外泌體可特異性表達(dá)HSP70、CD63。見圖1。

注：A為透射電鏡下血漿外泌體形態(tài)，放大倍數(shù)為50 000倍；B為Western blotting檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白HSP70和CD63表達(dá)。

2.2PHC組、肝硬化組、對(duì)照組血漿外泌體A1BG-AS1表達(dá)水平比較 對(duì)照組、肝硬化組、PHC組血漿外泌體A1BG-AS1表達(dá)水平分別為1.13±0.24、0.75±0.18、0.43±0.11，3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=240.812，P<0.01)；兩兩比較顯示，肝硬化組、PHC組血漿外泌體A1BG-AS1表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，PHC組血漿外泌體A1BG-AS1表達(dá)水平明顯低于肝硬化組(P<0.01)。

2.3血漿外泌體A1BG-AS1、AFP單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)對(duì)PHC的診斷價(jià)值 ROC曲線分析顯示，血漿外泌體A1BG-AS1單獨(dú)檢測(cè)診斷PHC的曲線下面積(AUC)為0.842(95%CI：0.774～0.896)，約登指數(shù)為0.722，截?cái)嘀禐?.61，靈敏度為89.33%，特異度為82.89%；AFP單獨(dú)檢測(cè)診斷PHC的AUC為0.829(95%CI：0.759～0.885)，約登指數(shù)為0.523，截?cái)嘀禐?08.62 ng/mL，靈敏度為76.00%，特異度為76.32%；A1BG-AS1、AFP聯(lián)合檢測(cè)診斷PHC的AUC為0.898(95%CI：0.839～0.941)，約登指數(shù)為0.657，靈敏度為90.67%，特異度為75.00%。見圖2。

圖2 血漿外泌體A1BG-AS1、AFP單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)診斷PHC的ROC曲線

2.4PHC患者血漿外泌體A1BG-AS1表達(dá)水平與臨床病理特征關(guān)系 根據(jù)PHC患者血漿外泌體A1BG-AS1表達(dá)水平的均值，將PHC患者分為高表達(dá)組(38例)和低表達(dá)組(37例)，χ2檢驗(yàn)顯示，不同腫瘤分期、肝功能分級(jí)和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移PHC患者血漿外泌體A1BG-AS1表達(dá)情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 PHC患者血漿外泌體A1BG-AS1表達(dá)水平與臨床病理特征關(guān)系

2.5PHC患者血漿外泌體A1BG-AS1水平與預(yù)后關(guān)系 Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，A1BG-AS1高表達(dá)PHC患者的3年生存率明顯高于A1BG-AS1低表達(dá)PHC患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.857，P=0.009)。見圖3。

圖3 不同血漿外泌體A1BG-AS1表達(dá)水平的PHC患者生存曲線

2.6影響PHC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析 Cox回歸模型單因素分析結(jié)果顯示，腫瘤分期為T3～T4、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、A1BG-AS1低表達(dá)是影響PHC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)；多因素分析結(jié)果顯示，腫瘤分期為T3～T4、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、A1BG-AS1低表達(dá)是影響PHC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表2。

表2 影響PHC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析結(jié)果

3 討 論

PHC是臨床常見惡性腫瘤之一，因其有生長(zhǎng)活躍、侵襲性強(qiáng)等特點(diǎn)，早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移，術(shù)后易復(fù)發(fā)，進(jìn)而影響患者生存。血清AFP是診斷肝癌的標(biāo)志物，但是靈敏度不高，因此，尋找其他腫瘤標(biāo)志物，以及對(duì)肝癌患者進(jìn)行早期篩查和預(yù)后判斷對(duì)肝癌患者的治療有重要意義[7]。

細(xì)胞在正常狀態(tài)與病理?xiàng)l件下均可分泌外泌體，外泌體中含有蛋白質(zhì)、lncRNA等，可在細(xì)胞間進(jìn)行信息傳遞，并影響靶細(xì)胞中的信號(hào)通路，進(jìn)而參與機(jī)體的病理生理過程。lncRNA是一類非編碼RNA，通過調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)參與細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移等多種生理過程，有研究報(bào)道，多種lncRNA與肝癌復(fù)發(fā)、診斷、預(yù)后、疾病進(jìn)展和耐藥性有關(guān)[8]。lncRNA可通過調(diào)節(jié)腫瘤血管生成、免疫系統(tǒng)活性、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源miRNA等多種機(jī)制參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。吳鋒等[9]研究顯示，lncRNA ZFAS1在HCC患者血清外泌體中高表達(dá)，與HCC患者腫瘤分期、Child-pugh分級(jí)、AFP水平、淋巴轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)，檢測(cè)血清外泌體lncRNA ZFAS表達(dá)水平對(duì)診斷HCC有一定參考價(jià)值，可作為HCC患者診斷及預(yù)后判斷的參考指標(biāo)。A1BG-AS1為lncRNA的一種，有研究顯示，A1BG-AS1通過海綿miRNA-485-5p調(diào)控脂閥結(jié)構(gòu)蛋白1的表達(dá)，調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移與侵襲[10]。關(guān)于A1BG-AS1在其他腫瘤外泌體中的表達(dá)的報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示，PHC組患者血漿外泌體A1BG-AS1表達(dá)水平明顯低于肝硬化組，肝硬化組血漿外泌體A1BG-AS1表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，提示A1BG-AS1可能與PHC的發(fā)生有關(guān)。目前，A1BG-AS1在乳腺癌組織與HCC組織中呈異常表達(dá)，而本研究發(fā)現(xiàn)其在PHC患者血漿外泌體也存在異常表達(dá)，但本研究臨床樣本量較小，可能存在一定局限性，其在PHC中是否具有特異性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。進(jìn)一步分析血漿外泌體A1BG-AS1表達(dá)水平與PHC患者臨床病理特征關(guān)系顯示，PHC患者血漿外泌體A1BG-AS1表達(dá)水平與腫瘤分期、肝功能分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與BAI等[4]研究結(jié)果一致，提示血漿外泌體A1BG-AS1低表達(dá)促進(jìn)PHC進(jìn)展與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，推測(cè)A1BG-AS1在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抑癌作用。本研究結(jié)果顯示，本研究血漿外泌體A1BG-AS1診斷PHC的AUC為0.842(95%CI：0.774～0.896)，靈敏度為89.33%，特異度為82.89%，提示檢測(cè)血漿外泌體A1BG-AS1對(duì)PHC具有一定診斷價(jià)值，A1BG-AS1、AFP聯(lián)合檢測(cè)診斷PHC的AUC為0.898(95%CI：0.839～0.941)，靈敏度為90.67%，特異度為75.00%，表明A1BG-AS1、AFP聯(lián)合檢測(cè)診斷PHC的診斷效能較高，有一定臨床應(yīng)用價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，A1BG-AS1高表達(dá)PHC患者的3年生存率明顯高于A1BG-AS1低表達(dá)PHC患者，提示血漿外泌體A1BG-AS1低表達(dá)患者生存率較低，檢測(cè)血漿外泌體A1BG-AS1表達(dá)水平可預(yù)測(cè)PHC患者預(yù)后。進(jìn)一步Cox回歸模型單因素和多因素分析結(jié)果顯示，腫瘤分期為T3～T4、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、A1BG-AS1低表達(dá)是影響PHC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示血漿外泌體A1BG-AS1表達(dá)水平可影響患者預(yù)后，其可能作為判斷PHC患者預(yù)后情況的分子標(biāo)志物。

綜上所述，PHC患者血漿外泌體A1BG-AS1低表達(dá)，其與患者臨床病理特征和預(yù)后有關(guān)，且血漿外泌體A1BG-AS1、AFP聯(lián)合檢測(cè)對(duì)PHC有較高診斷價(jià)值，可作為PHC診斷與判斷預(yù)后的標(biāo)志物，但具體機(jī)制尚不清楚，仍需做進(jìn)一步研究。