N6-甲基腺嘌呤修飾在黑色素瘤中作用的研究進展▲

江曉梅 謝萬著 黃少君 嚴 瑤 曾文俊 唐紅珍 李芳梅

(1 廣西中醫藥大學研究生院，南寧市 530001，電子郵箱：1622232545@qq.com；2 廣西國際壯醫醫院皮膚科，南寧市 530001)

【提要】 N6-甲基腺嘌呤(m6A)修飾是真核生物mRNA的修飾之一，是一個復雜的過程。多個m6A相關蛋白參與黑色素瘤發病的調控，這些蛋白對黑色素瘤的發生、發展及耐藥有著重要的影響。本文對m6A修飾參與調控黑色素瘤的分子機制作一綜述，以期為黑色素瘤相關m6A修飾研究提供新的思路。

黑色素瘤是來源于黑素細胞、惡性病變程度較高的腫瘤，具有高度的侵襲性，且易發生早期轉移。近年來，黑色素瘤的發病率以3%～5%的年增長率迅速上升，且發病趨于年輕化，黑色素瘤病死例數占皮膚類癌病死總例數的65%以上[1]。大多數早期黑色素瘤患者的手術治愈率較高，但晚期患者預后較差，生存率較低[2]。探索黑色素瘤的發生、發展、耐藥機制，對尋找新的診斷指標及治療方法具有重要意義。

N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)修飾是指發生在mRNA、長非編碼RNA、轉移RNA等RNA的腺嘌呤上的甲基化修飾。m6A修飾為識別和調節RNA中的化學修飾，包括甲基轉移酶、去甲基化酶及甲基識別蛋白，通過調節RNA代謝、功能和定位對基因表達產生影響[3]。m6A修飾通過甲基轉移酶蛋白實現甲基化[4]。近年來研究表明m6A修飾參與多種人類疾病的發生和發展過程，其中m6A修飾可以通過調節癌基因和抑癌基因的mRNA表達水平來影響腫瘤的發展[5]。目前m6A修飾調控黑色素瘤的相關研究仍然有限。本文對m6A修飾與黑色素瘤發生、發展之間的關系，以及m6A修飾在腫瘤耐藥中的作用作一綜述，以期為黑色素瘤的治療提供新策略。

1 m6A修飾概述

m6A修飾是哺乳動物最常見的內部RNA修飾，包括mRNA前體剪接、易位及穩定性，從而調控mRNA的翻譯。m6A修飾由RNA甲基轉移酶復合物催化，該復合物由甲基轉移酶樣蛋白(methytransferase-like protein，METTL)3及其相互作用的蛋白組成，后者包括METTL14、剪接因子維爾姆斯瘤1相關蛋白(Wilms′tumor 1-associating protein,WTAP)、新蛋白[病毒樣m6A甲基轉移酶相關蛋白(vir like m6A methyltransferase associated protein,VIRMA)]和其他尚未鑒定的蛋白。m6A的去除由RNA去甲基化酶脂肪量與肥胖相關蛋白(fat mass and obesity associated protein,FTO)以及烷基化DNA修復蛋白AlkB同系物(alkylated DNA repair protein AlkB homolog，ALKBH)5催化。m6A結合蛋白，即含YTH結構域的蛋白[如含YTH結構域的家族蛋白(YTH domain-containing family protein,YTHDF)1、YTHDF2和YTHDF3]可以特異性結合修飾的RNA并影響其穩定性和翻譯。m6A修飾除了在干細胞分化、精子發生和應激反應等關鍵過程中發揮調節核糖核酸代謝的生理作用，在腫瘤的發生和發展中也具有重要作用[6]。

m6A甲基轉移酶復合物可以催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)的甲基轉移至腺嘌呤第6位氮原子上，其中METTL3、METTL14定位在細胞核的亞細胞器—核小斑，并且間接調節WTAP，這是一種獨特的核定位模式[7]。研究顯示METTL3是一種SAM結合蛋白，是m6A甲基轉移酶復合體的核心成分;其識別潛在的m6A位點，并將附著在SAM上的甲基轉移到這些位點上，通過多種途徑影響癌癥的發生[8]。METTL14雖然與METTL3同源，但是缺少酶的催化結構域，被認為是為提高METTL3催化活性提供RNA的結合平臺。WTAP也不具備酶的活性，其主要功能是幫助METTL3和METTL14復合體定位到核小斑[9]。然而METTL3作為最主要的m6A甲基轉移酶,僅僅結合約22%的m6A位點[10]。隨著研究的深入，METTL16、ZC3H13、KIAA1429、 RBM15和CBLL1等甲基轉移酶陸續被發現[11]，并且在m6A修飾中起著重要作用。例如METTL16可結合于U6 snRNA，導致U6第43位的腺嘌呤發生m6A甲基化修飾，從而影響U6對mRNA前體的剪接[12]。

去甲基化酶主要由ALKBH家族組成，包括ALKBH1-8、FTO。ALKBH家族最突出的特點是依賴Fe2+和α-酮戊二酸結構域進行底物催化[13]。有學者發現，FTO可通過調節mRNA的m6A的甲基化水平，影響mRNA的穩定性及翻譯過程[14]；ALKBH5對特定基因的m6A修飾位點去甲基化，參與多種疾病的發生和發展。

m6A修飾的閱讀蛋白主要包括YTHDF蛋白家族。m6A修飾在細胞質轉錄水平的作用主要依靠YTHDF家族特殊的結合位點及其一些網絡機制來實現[5,15]，其中YTHDF1與YTHDF3的結合位點主要分布在mRNA的3′端非編碼區和終止密碼子[16-17]。既往觀點認為甲基化位點的轉化過程只要甲基化的底物轉錄發生甲基化，都可以被閱讀蛋白(YTHDF等)家族成員識別，并且m6A修飾的多種效應與甲基化位點不存在密切的聯系[18-19]。最近有研究結果顯示，對于甲基轉移酶的共有基序RRACH而言，其甲基化位點主要發生在終止密碼子周圍，但m6A特異位點聚集在5′端非編碼區至轉錄起始位點的區域[20]。有實驗表明，m6A被閱讀蛋白酶YTHDF2識別后，通過選擇性地結合mRNA的衰減位點以影響mRNA的翻譯狀態和衰亡[21]。這些研究結果提示甲基化的特異位點與共有位點有所差異。此外，有學者發現某些mRNA能夠以相似的方式識別并結合YTHDF家族的3種同源蛋白(YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3)，3種同源蛋白可結合相同的mRNA以促進mRNA的翻譯和降解[22]。YTHDF1～3主要存在于細胞質，其中YTHDF1在多種腫瘤中過度表達，免疫組織化學染色顯示其表達與多種惡性腫瘤行為有關，如腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移和腫瘤分期等[3]。

2 m6A修飾與黑色素瘤的發生和發展之間的關系

目前，在腫瘤發生及發展機制的生物學研究中，m6A修飾已成為研究熱點之一。在黑色素瘤的發生和發展中，m6A修飾起著關鍵性的作用。m6A相關蛋白的異常表達可導致黑色素瘤細胞的增殖、轉移、侵襲及耐藥。m6A修飾與黑色素瘤的主要關系見圖1。

圖1 黑色素瘤中的m6A修飾及其調節蛋白

2.1 甲基轉移酶 黑色素瘤早期容易發生轉移，因此針對m6A修飾如何調控腫瘤細胞的轉移、增殖進行研究有重要的意義。METTL3作為癌基因，在人類癌癥中起致癌和抑癌雙重作用，其可通過調節關鍵轉錄底物的m6A甲基化水平來促進多種癌癥的發生和發展[23]。例如，METTL3在人類肝細胞癌組織中表達顯著上調，且敲除METTL3可抑制體外培養的肝細胞癌細胞增殖，以及體內致瘤性和肺轉移[24]。有學者發現，METTL3在人類黑色素瘤組織中表達上調，從而激活了基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)2，促使c-Met、p-Akt蛋白的表達，導致黑色素瘤細胞集落形成，最終引起黑色素瘤細胞侵襲[25]。細胞間質上皮轉換因子(cellular-mesenchymal to epithelial transition factor，c-Met)是一種細胞表面酪氨酸激酶，是多種癌癥發生的驅動因子，除了受miRNA調節外，也直接受RNA m6A修飾的調控。有研究表明在罕見的黑色素瘤-葡萄膜黑色素瘤中，METTL3表達上調介導了c-Met/蛋白激酶B信號通路的激活從而影響葡萄膜黑色素瘤細胞的增殖[11]。由此可見，METTL3可以促進黑色瘤細胞的增殖及轉移，因此敲除METTL3可抑制腫瘤細胞的增殖及轉移，而監測METTL3的表達情況，對腫瘤的預后有著重要的意義。

2.2 去甲基化酶 FTO是第一個被發現的m6A去甲基化酶，表明m6A修飾的RNA甲基化是可逆的，且呈動態變化，因此具有重要的生理和病理功能[26]。FTO是黑色素瘤的一種原生因子，黑色素瘤中的FTO表達水平增加，機體通過自噬和核因子κB途徑誘導FTO表達，以及影響m6A RNA修飾及其去甲基化酶活性，從而調節其靶基因程序性死亡蛋白1(programmed death protein 1，PD-1)的表達，進而促進腫瘤的發生和發展。在有關黑色素瘤的體外實驗研究中，敲除FTO基因后，機體可通過γ-干擾素調節組織中PD-1、C-X-C基序趨化因子受體4和SRY盒轉錄因子10的水平，誘導巨噬細胞對黑色素瘤細胞的殺傷作用，進而增強機體對抗PD-1阻斷的反應[27]。

此外，去甲基化酶ALKBH5的表達也與致癌或抑癌作用有關，例如，敲除ALKBH5可通過降低叉頭盒轉錄基因M1的m6A修飾水平來抑制肺腺癌細胞的增殖和侵襲；ALKBH5可通過改變Wnt抑制因子1的表達來抑制胰腺癌轉移[28]。但ALKBH5在人類癌癥中的潛在機制尚未完全清楚[29]。在人黑色素瘤細胞中ALKBH5可調節靶基因單羥酸轉運蛋白4/單羥酸轉運蛋白3的表達和剪接，ALKBH5可通過調節腫瘤微環境的乳酸濃度和血管內皮生長因子α的積累來調節免疫抑制性骨髓間充質干細胞和調節性T淋巴細胞的募集，從而促進腫瘤生長。

2.3 m6A結合蛋白 在黑色素瘤中，YTHDF1起到抑癌作用。HINT2是甲基識別蛋白家族的靶點，作為抑癌基因其可促進腫瘤細胞凋亡和死亡，經YTHDF1的識別可以促進眼黑色素瘤抑制基因HINT2甲基化的翻譯過程，從而抑制細胞生長和遷移[30]。有研究發現，與正常對照組織相比，眼黑色素瘤組織、細胞中HINT2 mRNA的m6A修飾減少，HINT2蛋白表達下調[30]。

3 m6A修飾與黑色素瘤耐藥性之間的關系

在黑色素瘤的治療中，耐藥是導致治療失敗的原因。最新研究表明m6A修飾在抗腫瘤的免疫治療中影響免疫反應和黑素瘤細胞敏感性[31]。深入研究m6A修飾與黑色素瘤耐藥的分子機制，可指導臨床用藥。

黑色素瘤細胞中METTL3/METTL14的缺陷促進了IFN-γ-Stat1-Irf1炎癥信號傳導，從而增加腫瘤微環境中的CD8+T淋巴細胞的數量，以及IFN-γ、Cxcl9和Cxcl10趨化因子的分泌，增強黑色素瘤對抗PD-1治療的敏感性[32]。Li等[33]研究發現，ALKBH5的缺失，導致了腫瘤微環境中乳酸鹽含量的變化，可以減少腫瘤疫苗GVAX/抗PD-1治療期間免疫細胞亞群的募集，提高GVAX/抗PD-1治療的功效。T淋巴細胞對腫瘤新抗原的自發啟動，有利于提高臨床免疫治療的效果。但許多患者體內的新抗原識別能力不足以誘導持久的T淋巴細胞反應。有學者發現，T淋巴細胞中YTHDF1的缺失，增強了CD8+T淋巴細胞的主要抗原遞呈細胞，即樹突狀細胞的交叉啟動能力，促進T淋巴細胞識別腫瘤新抗原，從而啟動早期細胞免疫[34]。另有研究表明，YTHDF1蛋白高表達與腫瘤惡性程度有關，表達程度越高，則患者預后越差，敲除YTHDF1后，腫瘤細胞對氟尿嘧啶和奧沙利鉑的敏感性明顯增高[35]。但目前m6A結合蛋白與黑色素瘤免疫耐受之間關系的研究報告相對較少。

4 總結與展望

m6A修飾是mRNA中最常見的修飾，廣泛存在于真核生物，具有動態可逆性的特點，幾乎參與了mRNA的產生到降解的整個生物學過程。m6A修飾是一把“雙刃劍”，主要通過調節癌基因或抑癌基因的mRNA水平來促進或抑制腫瘤的發生和發展。它可以調節腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、分化，提高腫瘤細胞對放化療的敏感性。隨著對m6A作用機制研究的深入，其生物學過程或可被詳細揭示。但在黑色素瘤的發病中，m6A的甲基化功能和作用機制尚未完全清楚。進一步研究m6A的甲基化功能及其調控因子的分子機制，可以為黑色素瘤的臨床診斷和靶向治療提供依據。

免疫抑制劑在黑色素瘤的治療中取得了重大的突破，使越來越多的黑色素瘤患者受益，但耐藥性的出現又導致療效不佳。m6A修飾可經過多條通路調控黑色素瘤對免疫抑制劑的耐藥性，m6A相關蛋白有可能成為控制腫瘤耐藥性的新靶點，且隨著新m6A修飾組分的發現，m6A甲基化對腫瘤耐藥性的研究將得到進一步發展。