基于PI3K/Akt信號(hào)通路探究鹿靈活絡(luò)顆粒對(duì)神經(jīng)根型頸椎病大鼠炎癥反應(yīng)的影響

朱 棟，許金海，莫 文

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院骨傷科，上海 200032）

鹿靈活絡(luò)合劑為本院治療CSR的自制藥劑，基于石筱山經(jīng)驗(yàn)方配制而成，具有益氣活血，祛瘀止痛等功效，前期研究證實(shí)能有效緩解CSR癥狀[1]。為解決合劑在配制及臨床使用中的不便，本院進(jìn)一步改良工藝完成鹿靈活絡(luò)顆粒的配制，并在醫(yī)院中大量使用，截至目前未見不良反應(yīng)。本研究在前期研究基礎(chǔ)上建立CSR大鼠模型，基于磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路初步分析鹿靈活絡(luò)顆粒治療CSR的藥理機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

48只SD雄性大鼠，體質(zhì)量（180±20）g，購自上海甲干生物科技有限公司，合格證號(hào)[SCXK（滬）2020-0006]。購入后在上海中醫(yī)藥大學(xué)龍華醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房中飼養(yǎng)1周［SYXK（滬）2018-0036］，以適應(yīng)環(huán)境。

1.2 藥物、試劑和儀器

鹿靈活絡(luò)顆粒（本院自制藥，滬藥制備字Z20200065000）；莫比可（即美洛昔康片，上海勃林格殷格翰藥業(yè)公司）；多聚甲醛、HE試劑、大鼠白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、IL-6、環(huán)氧合酶2（COX2）、前列腺素2（PEG2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（上海生工公司）；p-Akt、GAPDH、PI3K、Akt抗體、HRP二抗（Abcam公司）；組織研磨器（寧波新芝生物科技公司）；普通顯微鏡（Leica公司）；電泳儀器（BioRad公司），酶標(biāo)儀（Thermo公司）等。

1.3 方法

1.3.1 造模及給藥處理 造模前觀察大鼠步態(tài)均正常。禁食不禁水12 h后，隨機(jī)選取40只大鼠麻醉，采用本院新創(chuàng)的頸前鎖骨下入路椎管外臂叢神經(jīng)壓迫法[2]構(gòu)建CSR大鼠模型。具體為：腹腔麻醉（戊巴比妥鈉35 mg·kg-1）后俯臥位固定大鼠，切開右側(cè)鎖骨肌膚，暴露臂叢神經(jīng)，用4-0鉻制羊腸線將臂叢神經(jīng)結(jié)扎并固定于鎖骨，每間隔1 mm結(jié)扎1道，共3道。結(jié)扎強(qiáng)度以打結(jié)時(shí)上肢肌肉輕微抖動(dòng)、線結(jié)可沿臂叢神經(jīng)輕微滑動(dòng)為宜。最后逐層縫合肌肉和皮膚并腹腔注射青霉素防感染。假手術(shù)（sham）組（8只）暴露臂叢神經(jīng)后立即縫合。術(shù)后第3天對(duì)大鼠步態(tài)進(jìn)行評(píng)分，得分為2～3分認(rèn)為CSR模型成功。隨機(jī)將CSR大鼠分為CSR組、低、中、高劑量鹿靈活絡(luò)顆粒組、莫比可組，每組8只。低、中、高劑量鹿靈活絡(luò)顆粒組大鼠分別給予（3.085/X） g·kg-1、（6.17/X）g·kg-1、（12.34/X） g·kg-1灌胃治療28 d，大鼠給藥劑量按照體表面積換算，其中中劑量鹿靈活絡(luò)顆粒相當(dāng)于臨床對(duì)病人的用藥劑量；莫比可組大鼠（0.77125/X） mg·kg-1灌胃治療[3]；以上藥物溶解于蒸餾水溶液中，配置成（10/X） mL體積的混合物，混合均勻后，灌胃；sham組、CSR組大鼠等量生理鹽水灌胃，每日1次。X為喂藥當(dāng)天大鼠體質(zhì)量，單位為kg。

1.3.2 標(biāo)本采集及HE染色 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，麻醉處死大鼠，超凈臺(tái)中取C6/C7和C7/T1區(qū)神經(jīng)根組織，將C6/C7區(qū)置于4%多聚甲醛固定，制備石蠟切片，經(jīng)HE染色后觀察神經(jīng)根組織形態(tài)。另外，將C7/T1區(qū)組織液氮速凍后保存，以提取蛋白質(zhì)。

1.3.3 ELISA 檢測(cè)神經(jīng)根中 IL-6、IL-1β、NF-κB、TNF-α含量 取1.3.2中適量神經(jīng)根組織，加入PBS，勻漿后收集上清，采用大鼠ELISA試劑盒測(cè)定神經(jīng)根中 IL-6、IL-1β、NF-κB、TNF-α 含量。

1.3.4 Western blot檢測(cè)神經(jīng)根中PI3K/Akt/mTOR通路蛋白水平 將1.3.2中適量神經(jīng)根組織，加入RIPA裂解液，勻漿后收集神經(jīng)根中總蛋白。分別將30 mg蛋白煮沸后電泳分離并轉(zhuǎn)膜，封閉后分別加入PI3K、Akt、mTOR、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR一抗（1:1 000）孵育過夜，再與二抗（1:5 000）結(jié)合1 h后，用ECL顯色并拍照分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 25和GraphPad 8.0分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鹿靈活絡(luò)顆粒對(duì)CSR大鼠神經(jīng)根組織形態(tài)的影響

sham組神經(jīng)節(jié)及神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)完整，髓鞘清晰可見；CSR組可見個(gè)別變性神經(jīng)細(xì)胞、較多髓鞘脫失和空泡樣等病變；莫比可組及中、高劑量鹿靈活絡(luò)顆粒組脫髓鞘等病變明顯改善，而低劑量鹿靈活絡(luò)顆粒組未見明顯改善。見圖1。

圖1 各組神經(jīng)根組織形態(tài)（HE染色，×200）

2.2 鹿靈活絡(luò)顆粒對(duì)CSR大鼠神經(jīng)根中IL-6、IL-1β、NF-κB、TNF-α 含量的影響

見表1。

表1 各組IL-6、IL-1β、NF-κB、TNF-α 含量比較（±s，n=8） pg·mL-1

表1 各組IL-6、IL-1β、NF-κB、TNF-α 含量比較（±s，n=8） pg·mL-1

注：與sham組比較，# P＜0.05；與CSR組比較，△P＜0.05；與低劑量鹿靈活絡(luò)顆粒組比較，▲P＜0.05；與中劑量鹿靈活絡(luò)顆粒組比較，□P＜0.05

組別 IL-6 IL-1β NF-κB TNF-α sham 組 1.74±0.30 37.00±8.96 3.20±0.30 15.09±2.79 CSR 組 5.54±0.77# 116.90±23.44# 5.83±0.77# 46.55±7.20#低劑量鹿靈活絡(luò)顆粒組 5.20±0.97# 111.42±32.41# 5.65±1.07# 43.19±6.58#中劑量鹿靈活絡(luò)顆粒組 4.52±0.78#△▲ 91.58±24.94#△▲ 5.00±0.82#▲ 37.14±5.46#△高劑量鹿靈活絡(luò)顆粒組 3.56±0.61#△▲ 75.58±21.16#△▲ 4.47±0.70#△▲ 28.57±3.88#△▲□莫比可組 3.16±0.48#△▲□ 68.33±17.37△▲ 4.24±0.57△▲ 26.61±3.52#△▲□

2.3 鹿靈活絡(luò)顆粒對(duì)CSR大鼠神經(jīng)根PI3K/Akt/mTOR通路的影響

見圖2、表2。

表2 各組PI3K/Akt/mTOR通路蛋白水平比較（±s，n=8）

表2 各組PI3K/Akt/mTOR通路蛋白水平比較（±s，n=8）

注：與sham組比較，# P＜0.05；與CSR組比較，△P＜0.05；與低劑量鹿靈活絡(luò)顆粒組比較，▲P＜0.05；與中劑量鹿靈活絡(luò)顆粒組比較，□P＜0.05

組別 PI3K/ACTIN p-PI3K/ACTIN Akt/ACTIN p-Akt/ACTIN mTOR/ACTIN p-mTOR/ACTIN sham 組 0.87±0.03 0.41±0.03 1.04±0.03 0.66±0.03 0.83±0.05 0.32±0.01 CSR 組 0.88±0.02 1.05±0.07# 1.00±0.03 1.34±0.02# 0.79±0.07 0.83±0.04#低劑量鹿靈活絡(luò)顆粒組 0.87±0.06 0.95±0.06#△ 0.98±0.05# 1.24±0.03#△ 0.78±0.05 0.78±0.03#中劑量鹿靈活絡(luò)顆粒組 0.88±0.07 0.84±0.04#△▲ 1.01±0.03 1.06±0.03#△▲ 0.81±0.03 0.74±0.03#△高劑量鹿靈活絡(luò)顆粒組 0.87±0.07 0.78±0.02#△▲ 1.02±0.02 1.03±0.03#△▲ 0.81±0.04 0.52±0.02#△▲□莫比可組 0.87±0.02 0.65±0.03#△▲□ 1.03±0.01 0.99±0.02#△▲□ 0.83±0.03 0.51±0.03#△▲□

圖2 各組神經(jīng)根中蛋白western blot檢測(cè)圖

3 討論

本研究采用自創(chuàng)方法建立CSR大鼠模型，結(jié)果顯示，造模大鼠步態(tài)評(píng)分改變，HE染色顯示神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)變性、髓鞘脫失和空泡樣等病變，表明模型制備成功。中、高劑量鹿靈活絡(luò)顆粒治療后，神經(jīng)根組織病變減輕，表明中、高劑量鹿靈活絡(luò)顆粒可改善神經(jīng)組織病變，對(duì)CSR大鼠具有鎮(zhèn)痛作用。另外，高劑量組并未比中劑量效果更好，提示超臨床劑量并不能提高鹿靈活絡(luò)顆粒的藥效。

研究[4]顯示，涉及炎癥介質(zhì)釋放和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活的神經(jīng)炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)性疼痛。炎癥介質(zhì)如 IL-6、IL-1β、NF-κB、TNF-α等可以誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)降解或神經(jīng)向內(nèi)生長，加劇椎間盤退變，造成慢性疼痛[5]。IL-1β是啟動(dòng)神經(jīng)炎癥的重要因子，可介導(dǎo)神經(jīng)組織中小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，趨化聚集在損傷位置并分泌TNF-α、IL-6等，介導(dǎo)疼痛反應(yīng)[6]。抑制炎癥相關(guān)途徑可減輕神經(jīng)炎癥性疼痛[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，中、高劑量鹿靈活絡(luò)顆粒治療28 d后，CSR大鼠神經(jīng)根中IL-6、IL-1β、NF-κB、TNF-α含量均降低，表明鹿靈活絡(luò)顆粒可抑制炎性介質(zhì)釋放，可能是其減輕CSR大鼠疼痛的原因。

PI3K/Akt/mTOR通路為將胞外信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)的重要途徑。有研究[8]證實(shí)，在腦出血小鼠中激活PI3K/Akt通路可以減輕神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元凋亡，實(shí)現(xiàn)腦保護(hù)作用。而且，在頸椎病動(dòng)物模型中，針刀[9]或電針[3]也可通過激活PI3K/Akt通路減輕細(xì)胞凋亡達(dá)到治療疾病的效果。本研究顯示，CSR大鼠神經(jīng)根中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR水平升高，推測(cè)PI3K/Akt/mTOR通路可以反應(yīng)神經(jīng)炎癥水平。而經(jīng)過中、高劑量鹿靈活絡(luò)顆粒治療后，p-PI3K、p-Akt、p-mTOR明顯下降，提示鹿靈活絡(luò)顆粒可以明顯減輕神經(jīng)炎癥，從而減少PI3K/Akt/mTOR通路的磷酸化。PI3K/Akt通路活化后可促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)因子表達(dá)，也可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎性活化[10]。因此推測(cè)，PI3K/Akt/mTOR通路可能是鹿靈活絡(luò)顆粒治療CSR的重要靶點(diǎn)。

綜上所述，臨床劑量的鹿靈活絡(luò)顆粒可減少受損神經(jīng)根中炎性介質(zhì)釋放，減少PI3K/Akt/mTOR通路的磷酸化，改善CSR大鼠神經(jīng)炎癥，減輕疼痛。本研究可為推廣鹿靈活絡(luò)顆粒的臨床應(yīng)用提供理論支持，然而鹿靈活絡(luò)顆粒在治療CSR過程中可能同時(shí)作用于多個(gè)靶點(diǎn)，需要進(jìn)一步探究。