不同粒徑微塑料對劍尾魚腸道消化、抗氧化及免疫酶活性影響

楊兵坤， 張彥坤， 謝鵬飛， 張春暖， 徐世曉， 孫平*

(1. 河南科技大學動物科技學院，河南洛陽471003； 2. 中國科學院西北高原生物研究所，西寧810008)

塑料制品因質輕、防水、絕緣、耐用和抗腐蝕等優點，在人類生產生活中得到廣泛應用。據統計，全球每年的塑料使用量不少于3.5×10t，塑料制品在自然環境下難降解，導致環境中的廢棄塑料越來越多(侯淼淼等，2020)。廢棄塑料如塑料袋、礦泉水瓶、一次性飯盒、廢棄漁網等在物理、化學或其他因素作用下分解成更小的塑料碎片或顆粒，其中直徑<5 mm的塑料碎片或顆粒被稱為微塑料(Thompson.，2004)。部分微塑料顆粒會隨降雨或地表徑流等進入水環境，因其大小與浮游生物相似，而極易被水生生物誤食，如：微塑料會引起牡蠣、貽貝、鯡海鯛等消化道堵塞(Pascal & Patricia 2016；Rossana.，2016；Savoca.，2019)，導致這些動物的攝食率降低，嚴重時甚至引起個體死亡等(Saskia.，2016)。此外，被水生生物誤食的微塑料(Oliveira.，2013；Wright.，2013；Annika.，2016)還可以通過物理性損傷、載體效應(如富集其他污染物)、生物積累與食物鏈傳遞等途徑產生一系列生態毒理效應，如：行為毒性(如運動能力下降、攝食能力降低)、生殖毒性(如生長發育緩慢、繁殖速度降低)、免疫毒性(如引發機體免疫炎癥)、氧化應激(如造成機體氧化損傷)等(Moos.，2012；Julia.，2014；Rossana.，2016；Chen.，2017)。Ali等(2017)將斑馬魚幼魚暴露于聚苯乙烯微塑料環境中，其腸道過氧化氫酶(CAT)活性在暴露20 d時的表達量高于第10天；Wen等(2018)將七彩神仙魚暴露于70～80 μm聚苯乙烯微塑料環境 30 d后，發現其胰蛋白酶(TRY)活性顯著降低；Tang等(2020)將泥蚶暴露于30 μm微塑料環境中，發現其溶菌酶(LZM)活性隨著微塑料濃度的升高而降低。因此，推測聚苯乙烯微塑料對劍尾魚的消化、抗氧化及免疫酶活性也存在一定程度的影響，預期可能會造成消化酶活性降低、抗氧化酶活性和免疫酶活性升高。

劍尾魚是一種小型熱帶淡水魚類，也是我國首個通過審定的淡水魚類實驗動物，體型小、易飼養、繁殖力強、繁殖周期短、對多種重金屬毒物較敏感，可作為水環境監測、水產藥物安全性評價、化學用品毒性檢測、動物疾病檢驗及生態毒理學研究的模式魚類(吳淑勤等，2003)。關于微塑料對劍尾魚的毒效研究較少，因此本文以劍尾魚為實驗對象，將其暴露于粒徑1 μm、5 μm及混合粒徑聚苯乙烯微塑料環境中72 h，測定腸道中消化酶、抗氧化酶和免疫酶活性，以期積累微塑料對魚類生物毒性數據，并為深入研究微塑料的毒理學影響奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

5月齡紅眼紅體雄性劍尾魚購自陜西紅劍尾魚養殖基地，于實驗室內曝氣24 h的自來水中飼養與馴化。飼養與馴化過程中水體持續24 h曝氣及活性炭處理，氧溶解度≥5.7 mg·L。馴化及實驗過程中保持水溫27 ℃±1 ℃，pH7.2～7.6，光周期 14 h L∶10 h D。每天 09∶00 和 17∶00 喂食，飼料投喂量為劍尾魚體質量的3%，飼料購于深圳市寸金觀賞魚飼料有限公司。聚苯乙烯微塑料為粒徑1 μm與5 μm的球形單分散綠色熒光塑料微球，可均勻分散于水中，最大激發和發射波長為470 nm和526 nm，購于天津倍思樂色譜技術開發中心。

1.2 實驗方法

在實驗室馴化2周后，選取顏色和體型相近、活潑健康的個體(體質量1.63 g±0.29 g，體長5.6 cm±0.55 cm)作為實驗動物，濃度設置參考微塑料環境濃度調查結果及其對水生生物的毒性效應的研究方法(Watts.，2015；Yin.，2018)，試驗共分為7組：M0組(無微塑料)、M1-1組(微塑料顆粒直徑：1 μm，濃度：1×10粒/L)、M1-2組(微塑料顆粒直徑：1 μm，濃度：1×10粒/L)、M2-1組(微塑料顆粒直徑：5 μm，濃度：1×10粒/L)、M2-2組(微塑料顆粒直徑：5 μm，濃度：1×10粒/L)、M3-1組(微塑料顆粒直徑：1 μm與5 μm按顆粒數 1∶1 混合，濃度：1×10粒/L)和M3-2組(微塑料顆粒直徑：1 μm 與5 μm按顆粒數 1∶1 混合，濃度：1×10粒/L)。每個處理組設置3個重復，每個重復10尾，共210尾。暴露前配制各組聚苯乙烯微塑料溶液，并進行超聲波處理，確保微塑料顆粒均勻分布于水環境中，暴露期間的環境與馴養時保持一致，依據《化學品 魚類急性毒性試驗GB/T27861-2011》(中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會，2012)暴露72 h，實驗進行至36 h時更換1/3提前曝氣及活性炭處理過的水，并添加相應聚苯乙烯微塑料以維持暴露濃度。

72 h暴露實驗結束后，立即使用MS-222麻醉劑麻醉，待魚無反應后，用蒸餾水沖洗魚身3次，冰上解剖。每個重復中取3尾魚的腸道作為1個樣本，每個處理組6個平行樣本。剔除腸道外脂肪及內容物，用生理鹽水沖洗后裝入已編號的凍存管中，放入液氮中速凍，-80 ℃保存。取出凍存管中的腸道置于稱量紙上準確稱取其質量并記錄，按照體積(mL)∶質量(g)=9∶1 的比例加入預冷的生理鹽水，隨后在冰水浴中對腸道組織進行機械研磨，制成濃度為10%的組織勻漿，低溫高速離心(3 000 r·min，15 min)，取上清用于測定淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)、TRY、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)、CAT、丙二醛(MDA)、LZM和總蛋白活性。所有試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，測定方法及原理參照試劑盒說明書。

1.3 數據統計與分析

2 結果

2.1 1 μm聚苯乙烯微塑料對劍尾魚腸道消化酶、抗氧化酶和免疫酶活性的影響

隨著水環境中聚苯乙烯微塑料濃度的增加，AMS活性總體呈上升趨勢：M0組的AMS活性為(0.404 5±0.004 0) U·mg，M1-1組為(0.417 1±0.050 0) U·mg，未發生顯著變化(>0.05)，M1-2組為(0.430 9±0.007 8) U·mg，升高顯著(<0.05)。LPS活性顯著上升：M0組為(26.79±0.85) U·g，M1-1組和M1-2組顯著上升[(35.90±1.30) U·g和(49.26±1.83) U·g；<0.05]。TRY活性呈先上升后下降的趨勢：M0組為(850.05±69.23) U·mg，M1-1組顯著上升至(1 113.25±22.53) U·mg(<0.05)，M1-2組顯著下降為(969.67±16.66) U·mg(<0.05)，但仍高于M0組(圖1)。

隨著水環境中聚苯乙烯微塑料濃度的增加，SOD活性總體呈顯著下降趨勢：M0組為(122.46±3.75) U·mg，M1-1組和M1-2組顯著下降[(109.38±2.08) U·mg和(101.83±2.68) U·mg；<0.05]。GSH活性總體呈顯著下降趨勢：M0組為(83.08±3.19) U·g，M1-1組和M1-2組顯著下降[(65.63±1.90) U·g和(72.53±2.47) U·g；<0.05]。CAT活性總體呈上升趨勢：M0組為(18.47±0.49) U·mg，M1-1組和M1-2組顯著上升[(23.71±0.85) U·mg和(23.03±1.06) U·mg；<0.05](圖1)。

隨著水環境中聚苯乙烯微塑料濃度的增加，MDA活性總體呈上升趨勢：M0組為(5.66±0.11) nmol·mg，M1-1組和M1-2組顯著上升[(6.84±0.13) nmol·mg和(6.70±0.14) nmol·mg；<0.05]。LZM活性呈顯著上升趨勢：M0組為(244.85±12.89) U·mL，M1-1組和M1-2組顯著上升[(318.19±11.09) U·mL和(456.21±13.13) U·mL；<0.05](圖1)。

圖1 1 μm聚苯乙烯微塑料對劍尾魚腸道酶活性的影響Fig. 1 Effect of 1 μm polystyrene microplastic on intestinal enzyme activity of Xiphophorus helleri

2.2 5 μm聚苯乙烯微塑料對劍尾魚腸道消化酶、抗氧化酶和免疫酶活性的影響

隨著水環境中聚苯乙烯微塑料濃度的增加，AMS活性呈上升趨勢：M0組為(0.404 5±0.004 0) U·mg，M2-1 組為(0.436 5±0.010 5) U·mg，升高顯著(<0.05)，M2-2組為(0.505 8±0.005 6) U·mg，升高顯著(<0.05)。LPS活性呈顯著上升趨勢：M0組為(26.79±0.85) U·g，M2-1組和M2-2組顯著上升[(45.31±2.12) U·g和(50.13±1.79) U·g；<0.05]。TRY活性呈先上升后下降的趨勢：M0組為(850.05±69.23) U·mg，M2-1組顯著上升為(1 094.60±82.97) U·mg(<0.05)，M2-2組顯著下降為(1 023.27±28.79) U·mg(<0.05)，但仍高于M0組(圖2)。

隨著水環境中聚苯乙烯微塑料濃度的增加，SOD活性總體呈下降趨勢：M0組為(122.46±3.75) U·mg，M2-1組顯著下降至(95.99±1.66) U·mg(<0.05)，M2-2組顯著下降至(101.40±2.31) U·mg(<0.05)。GSH活性總體呈下降趨勢：M0組為(83.08±3.19) U·g，M2-1組和M2-2組顯著下降[(57.74±0.70) U·g和(55.25±1.03) U·g；<0.05]。CAT活性呈上升趨勢：M0組為(18.47±0.49) U·mg，M2-1組和M2-2組顯著上升[(21.01±0.66) U·mg和(23.08±0.61) U·mg；<0.05](圖2)。

隨著水環境中聚苯乙烯微塑料濃度的增加，MDA活性總體呈上升趨勢：M0組為(5.66±0.11) nmol·mg，M2-1組和M2-2組顯著上升[(6.83±0.90) nmol·mg和(6.82±0.71) nmol·mg；<0.05]。LZM活性呈顯著上升趨勢：M0組為(244.85±12.89) U·mL，M2-1組和M2-2組顯著上升[(359.55±6.44) U·mL和(476.67±9.14) U·mL；<0.05](圖2)。

圖2 5 μm聚苯乙烯微塑料對劍尾魚腸道酶活性的影響Fig. 2 Effects of 5 μm polystyrene microplastics on intestinal enzyme activity of Xiphophorus helleri

2.3 混合粒徑聚苯乙烯微塑料對劍尾魚腸道消化酶、抗氧化酶和免疫酶活性的影響

隨著水環境中聚苯乙烯微塑料濃度的增加，AMS活性總體呈上升趨勢：M0組為(0.404 5±0.004 0) U·mg，M3-1組和M3-2組上升[(0.441 2±0.008 9) U·mg和(0.457 4±0.009 5) U·mg；<0.05]。LPS活性呈先上升后下降的趨勢：M0組為(26.79±0.85) U·g，M3-1組顯著上升至(47.45±1.37) U·g(<0.05)，M3-2組下降至(53.93±1.24) U·g，仍顯著高于M0組(<0.05)。TRY活性呈上升趨勢：M0組為(850.05±69.23) U·mg，M3-1組顯著上升至(1 196.24±114.03) U·mg(<0.05)，M3-2組顯著上升至(1 020.18±45.34) U·mg(<0.05)，但仍高于M0組(圖3)。

隨著水環境中聚苯乙烯微塑料濃度的增加，SOD活性總體呈下降趨勢：M0組為(122.46±3.75) U·mg，M3-1組顯著下降至(105.53±3.08) U·mg(<0.05)，M3-2組下降至(109.01±1.68) U·mg(<0.05)。GSH活性總體呈下降趨勢：M0組為(83.08±3.19) U·g，M3-1組和M3-2組顯著下降[(72.83±0.73) U·g和(69.67±0.44) U·g；<0.05]。CAT活性呈上升趨勢：M0組為(18.47±0.49) U·mg，M3-1組和M3-2組顯著上升[(24.28±0.73) U·mg和(24.08±0.35) U·mg；<0.05](圖3)。

圖3 混合粒徑聚苯乙烯微塑料對劍尾魚腸道酶活性的影響Fig. 3 Effects of polystyrene microplastics with mixed particle sizes on intestinal enzyme activity of Xiphophorus helleri

隨著水環境中聚苯乙烯微塑料濃度的增加，MDA活性呈上升趨勢：M0組為(5.66±0.11) nmol·mg，M3-1組和M3-2組顯著上升[(6.51±0.94) nmol·mg和(6.56±0.12) nmol·mg；<0.05]。LZM活性呈上升趨勢：M0組為(244.85±12.89) U·mL，M3-1組和M3-2組顯著上升[(354.12±9.02) U·mL和(353.51±8.29) U·mL；<0.05](圖3)。

3 討論

3.1 不同粒徑微塑料對劍尾魚腸道消化酶活性的影響

在水生生物中，已經證實消化速率會影響機體的消化吸收能力，而消化酶活性水平是反映機體消化速率和能量吸收的相關指標(Gu.，2019)。其中,AMS、LPS和TRY分別參與碳水化合物、脂質纖維素和蛋白質的消化過程(Charlene.，2021)，在消化吸收過程中扮演重要角色。本研究發現攝入不同粒徑微塑料后劍尾魚腸道消化酶活性均發生改變，1 μm粒徑組、5 μm粒徑組和混合粒徑組中AMS、TRY和LPS 3種消化酶活性的變化結果基本一致，其中5 μm粒徑組較其他暴露組對AMS活性影響更大，但差異不顯著，各粒徑組暴露結果顯示，低濃度組中TRY活性升高顯著，高濃度組中AMS和LPS活性升高顯著，推測可能是微塑料暴露粒徑越大、濃度越高對劍尾魚腸道消化吸收能力影響更顯著。已有研究表明，將銀魚幼魚暴露于粒徑<40 μm聚氯乙烯微粒的環境96 h后，其腸道TRY活性顯著升高(Romano.，2018)，機體的消化吸收能力降低，與本研究結果相似。而Gu等(2020)將大黃魚暴露于粒徑 100 nm、濃度 1.8×10粒/mL的聚苯乙烯微塑料環境中14 d后，與對照組相比，其腸道TRY活性顯著降低，但AMS和LPS活性沒有顯著變化，結果仍會引起機體消化系統紊亂。Huang等(2020)將孔雀魚暴露于粒徑40 μm聚苯乙烯微塑料環境中 28 d 后，其腸道AMS、TRY和LPS活性均降低，導致機體從食物中獲得能量儲備的能力下降。Wang等(2020)將貽貝在粒徑2 μm聚苯乙烯微球環境中暴露14 d后，與對照組相比，其AMS和LPS活性均被顯著抑制，導致機體消化能力下降。由此看來，無論消化酶活性是升高還是降低，不同粒徑和濃度微塑料暴露均會對機體消化吸收造成影響，而本研究中消化酶活性升高的原因可能是劍尾魚個體較小、腸腔狹窄，攝入的微塑料在消化道內聚團、堆積造成機械阻塞，產生虛假“飽腹感”，導致機體攝入營養和能量不足(Watts.，2015)。機體通過增加消化酶活性的方式來提高對食物的消化率，補償其能量攝入的不足，從而維持機體正常需要。但微塑料對消化吸收的影響僅用消化酶活性的變化無法系統闡釋，接下來會進行更多的研究，如劍尾魚腸道組織切片及腸道微生物菌群分析等。

3.2 不同粒徑微塑料對劍尾魚腸道抗氧化酶活性的影響

機體內主要的抗氧化酶SOD、GSH和CAT等在抑制和分解自由基和預防氧化損傷等方面發揮著關鍵作用(Li LL.，2020)。已有研究表明，微塑料可以引起珊瑚、斑馬魚、貽貝、南美白對蝦、金魚等抗氧化酶活性的改變，從而誘發機體氧化應激(Soares.，2020；Wang.，2020；Hsieh.，2021；Xu.，2021)。本實驗中，5 μm粒徑組較其他暴露組對SOD和GSH活性影響更顯著，可能是該組劍尾魚腸道氧化損傷更嚴重。各暴露組中SOD和GSH活性顯著降低，CAT活性顯著升高，可能由于SOD和GSH是保護細胞免受氧化應激的內源性抗氧化酶，具有協同作用，同時CAT活性增加以維持體內抗氧化過程的動態平衡。Lei等(2018)將斑馬魚幼魚暴露于粒徑 0.1 μm、濃度1.5×10粒/L聚苯乙烯微塑料環境中，其GSH活性下降，推測微塑料暴露可能會導致機體能量代謝紊亂，誘發氧化損傷。Tang等(2018)將石珊瑚暴露于粒徑1 μm、濃度9×10粒/L聚苯乙烯微塑料環境中 12 h后，發現其SOD活性升高，機體出現氧化應激。而Carlo等(2015)將紫貽貝暴露于粒徑2 μm聚苯乙烯微塑料環境中，其SOD活性降低，且機體內脂質出現過氧化損傷，這與本研究結果基本相似，抗氧化酶活性的改變表明微塑料的攝入確實會干擾到機體內抗氧化系統穩態，當面對環境中微塑料的脅迫時，機體內抗氧化應激系統啟動，以抵御不良環境的刺激。但是微塑料暴露在腸道組織中誘導氧化損傷的詳細機制還需要進一步研究。

3.3 不同粒徑微塑料對劍尾魚腸道免疫酶活性的影響

MDA和LZM在非特異性免疫中起著至關重要的作用，被認為是評價機體內免疫狀況的重要指標。MDA是機體內重要的氧自由基的代謝產物，可間接反映細胞損傷程度(Xia.，2020)。而LZM由中性粒細胞和巨噬細胞產生，通過激活補體和巨噬細胞來清除病原菌(Liu.，2019)。在本研究中，5 μm粒徑組MDA和LZM的活性較其他 2組升高更顯著，可能是該組劍尾魚腸道免疫損傷更嚴重，但各粒徑組中MDA的結果未出現濃度效應，表明在環境污染或不利條件下，生物體試圖通過免疫反應來適應相關的不良環境。淡水微藻在粒徑300 nm、濃度100 mg·L微塑料環境中，MDA活性顯著升高，并出現脂質損傷(Li SX.，2020)，與本研究結果相似。大型蚤暴露于粒徑1 μm、濃度0.1 mg·L的聚苯乙烯微塑料環境中48 h后，MDA活性升高，并引起組織損傷(Zhang.，2019)。鯉魚暴露于粒徑6 μm、濃度 50 mg·L微塑料環境中60 d后，MDA活性顯著降低，相關基因表達量減少(Xia.，2020)。而將中華絨螯蟹暴露于粒徑 5 μm、濃度40 mg·L的微塑料環境中7 d、14 d、21 d后，LZM活性先升高后降低，出現酶活性被抑制的現象并引起毒性效應(Liu.，2019)。本研究采用的 72 h 急性微塑料暴露實驗中，尚未觀察到免疫酶活性先升高后降低的趨勢，下一步計劃采用短期和長期結合暴露實驗，觀察是否會出現免疫酶活性先升高再降低的趨勢，并結合個體、組織、細胞和基因水平進行測試，以便為進一步研究微塑料的免疫毒性效應奠定基礎。

在本研究中，5 μm粒徑組較其他暴露組對劍尾魚腸道消化酶、抗氧化酶及免疫酶活性影響更大，但差異不顯著。不同粒徑聚苯乙烯微塑料均會影響消化酶、抗氧化酶及免疫酶活性的表達，以此干擾劍尾魚對食物的消化和能量的吸收，并對腸道的抗氧化能力和免疫能力造成影響。