云南洞密蛛的種群遺傳結構初探

劉世梁， 林玉成*

(1. 四川大學生命科學學院，生物資源與生態環境教育部重點實驗室，成都610065；2. 四川大學生命科學學院，四川省瀕危野生動物保護生物學重點實驗室，成都610065)

洞穴是一個相對封閉的特殊生態系統，幾乎沒有陽光、沒有植物生長，有較為恒定且通常低于地表的溫度和有限的食物供應(Culver.，2009)。由于受洞穴極端環境的影響，生活在其中的專性洞穴物種結構相對簡單，并在時間和空間上相互隔離(Poulson & White，1969)。因此，在研究島嶼模型的進化過程、物種形成以及生物地理學等方面，洞穴被認為是天然的實驗室(Cooper.，2007；Page.，2008)。中國西南山地有世界上面積最大的喀斯特地區，是全球34個生物多樣性熱點地區之一(Luo.，2016)。云貴高原是中國南方喀斯特地區的核心地帶，地下有數千個洞穴，但洞穴中的主要生物群——陸生節肢動物卻很少被研究(Zhang & Li，2014)。其中洞穴蜘蛛在洞穴生態系統中擔任頂級捕食者的角色(Mammola.，2016)，并產生了多種對洞穴環境的功能適應性(Cardoso.，2011)，被認為是一個用來了解動物在極端環境下適應進化及過程的理想模型。對云貴高原的洞穴類球蛛的生物地理學研究發現，類球蛛科Nesticidae Simon, 1894小類球蛛屬Lehtinen & Saaristo, 1980起源于始新世，中新世時期的氣候變化迫使地表蜘蛛種群遷移到洞穴中，并隨著時間的推移定居下來(Ballarin & Li，2018)。許多地區正面臨著氣候變化、旅游開發和地下水污染等威脅，而分布在熱帶洞穴和大多數巖溶地區內的洞穴動物群幾乎未被研究過，迫切需要進行密集和廣泛的生物調查(Howarth，1983；Shu.，2013)。

在動物種群遺傳研究方面，由于母系遺傳、在不同物種間的同源性、受到強烈的選擇壓力而快速進化等特點，線粒體基因是適合用來探究遺傳多樣性的工具(Avise，2009)，其中，線粒體細胞色素c氧化酶亞基Ⅰ()基因已被成熟應用于蜘蛛的分子系統學研究(劉名信等，2012)。

云南洞密蛛隸屬蛛形綱Arachnida蜘蛛目Araneae密蛛科Mysmenidae，是一種個體微小的洞穴蜘蛛，最早發現于云南省個舊市郊的飛霞洞，宋大祥和朱明生(1994)將其命名為云南困蛛，放入球蛛科Theridiidae。Lin和Li(2008)根據云貴高原多個洞穴采獲的樣本，將其描述為齒勺洞密蛛并置于密蛛科。此后，二者被認為是同物異名(Li & Lin，2019)，根據國際動物命名法規的優先律原則，該種有效學名應為。

在地下相對穩定的極端環境條件下，洞穴隔離怎樣維持洞穴蜘蛛的種群穩定，對洞穴物種的遺傳多樣性有何影響等問題的研究較少，尚未得到合理的解釋。云南洞密蛛僅在云貴高原的8個洞穴中分布(宋大祥，朱明生，1994；Lin & Li，2008；Li & Lin，2019)，作為相互獨立的地理種群，其種群結構、遺傳多樣性及演化歷史等方面的研究未見報道。本研究選取6個相互隔離的云南洞密蛛地理種群[關牛洞(GN)、野佬大洞(YLD)、清虛洞(QX)、十里大洞(SLD)、仙人洞(XR)、白巖洞(BY)]，通過分析、比較不同種群的遺傳多樣性和種群分化，以期探討洞穴隔離對云南洞密蛛種群遺傳結構的影響。

1 材料與方法

1.1 研究材料

2020年8月在云貴高原的6個洞穴中采獲503號樣本(表1)。所有樣本均用95%的分析純乙醇浸泡，-20 ℃凍存。標本保存于四川大學自然博物館(NHMSU)動物標本室。

表1 云南洞密蛛樣本采集位點基本信息Table 1 Basic information about sampling sites of Trogloneta yunnanense

1.2 基因組DNA提取、PCR擴增和測序

每個洞穴種群選取20～30只個體作為分子材料，用于開展種群遺傳研究。每個采集位點隨機選取包含雌雄和幼體在內的個體樣本進行實驗，為避免腹部腸道內容物帶來的外源基因影響，僅取每只個體的頭胸甲用于分子實驗。使用QIAGEN血液和組織提取試劑盒(Qiagen；P/N：69506)提取基因組DNA。雄性的觸肢器和雌、雄腹部均保留作為分子憑證。基因的擴增和測序引物為LCOI490(5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’)和HCO2198(5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAA TCA-3’)。PCR反應體系25 μL：模板4 μL，引物各0.5 μL(10 mmol·L)，ddHO 7.5 μL，2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix(with blue dye)12.5 μL。擴增條件：95 ℃ 30 min；94 ℃ 30 s,48.95 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35個循環；72 ℃ 6 min。PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，送北京擎科生物科技有限公司成都分公司純化和測序。

1.3 序列分析

測序數據使用Bioedit 7.2.5(Hall，1999)進行檢查和編輯。MEGA X(Kumar.，2018)用于翻譯和對齊序列，并基于Kimura雙參數距離模型計算堿基組成、轉換與顛換值。基于-distance計算種群間的遺傳距離，并構建鄰接(NJ)樹。利用DNAsp 6.0(Rozas.，2017)計算平均核苷酸差異數(k)、單倍型數量(h)、單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(π)，并進行中性檢驗和核苷酸錯配分布檢驗。使用PopArt 1.7(Leigh & Bryant，2015)構建Templeton-Crandall-Sing(TCS)網絡(Clement.，2000)。利用Arlequin 3.5(Excoffier.，2005)進行分子方差分析，并計算種群遺傳分化指數()和種群間基因流(Nm)。

利用貝葉斯推斷(BI)和最大似然法(ML)重建系統發育樹。基于AIC準則使用PartitionFinder2(Lanfear.，2017)選擇最適合的核苷酸替換模型為GTR+G，并使用MrBayes(Ronquist.，2012)構建BI系統發育樹，4個馬爾可夫鏈蒙特卡羅(MCMCs)采用默認參數運行200萬代，抽樣頻率為200代一次，獨立運行2次。基于AIC準則使用ModelFinder(Kalyaanamoorthy.，2017)選擇的最適合核苷酸替換模型為TIM3+F+I+G4，使用IQTREE 1.6.12(Nguyen.，2015)構建ML系統發育樹，節點支持值使用1 000次自展分析重復檢測。

2 結果與分析

2.1 COⅠ基因序列變異分析

共獲得159個樣本部分基因，序列長度為630 bp，變異位點32個，包括2個單變異位點和30個簡約信息位點。轉換/顛換比為20.09，堿基組成為：T(44.00%)、A(26.16%)、C(11.89%)、G(17.95%)。A+T含量高于C+G含量。159個樣本共包含16個單倍型(GenBank登錄號分別為MZ577427、MZ577392、MZ577393、MZ577418、MZ577440、MZ577446、MZ577404、MZ577405、MZ577410、MZ577379、MZ577417、MZ577425、OM920931、OM920932、OM920935、OM920975)。

2.2 種群遺傳多樣性和遺傳結構

6個地理種群間未發現共享單倍型，種群內單倍型之間的差異不超過4個核苷酸。QX遺傳多樣性最高(k=1.305，Hd=0.553，π=0.002 07)，其次為BY(k=1.073，Hd=0.607，π=0.001 70)。而遺傳多樣性最低的是GN，僅有1個單倍型(表2)。整體而言，云南洞密蛛總體的k為10.021，Hd為0.888，π為0.015 91。

表2 云南洞密蛛種群內的遺傳多樣性指數Table 2 Genetic diversity indices of Trogloneta yunnanense within populations

以單倍型構建的NJ樹與TCS單倍型網絡結構相符，6個地理種群可分為2個大的譜系，其中YLD、GN與XR聚為一支；SLD、BY與QX聚為一支(圖1)，2大譜系下的次級分支顯示各個地理種群均為獨立的譜系，它們之間不存在共享單倍型。

圖1 基于種群遺傳距離構建的NJ樹(左)和單倍型構建的TCS網絡(右)Fig. 1 NJ tree (left) based on the population genetic distance and TCS network (right) based on haplotypes

2.3 云南洞密蛛的種群分化與基因流

6個地理種群中，YLD和GN之間的遺傳距離最近(=0.005 10)，最遠的是BY和GN(=0.026 29)，其他種群間的遺傳距離在0.011 70～0.025 48之間(表3)。6個種群間的值均在0.9以上,存在極顯著差異(<0.01)(表4)。AMOVA分析顯示，種群間變異占總變異的95.75%，種群內變異占總變異的4.25%，并且統計檢驗極顯著(<0.001；表5)。根據Hudson等(1992)的基因多樣性算法，6個種群間的遺傳分化指數為0.953 4，說明總變異的95.34%來自不同種群間的差異。

表3 基于COⅠ基因云南洞密蛛6個種群間的遺傳距離Table 3 The genetic distance among 6 Trogloneta yunnanense populations based on COⅠ gene

表4 云南洞密蛛6個種群間的遺傳分化指數Table 4 Genetic differentiation index among 6 Trogloneta yunnanense index populations

表5 云南洞密蛛6個種群的分子方差分析Table 5 AMOVA analysis among 6 Trogloneta yunnanense populations

2.4 系統發育分析

使用BI法和ML法構建的系統發育拓撲結構基本相同。除YLD外(PP=0.45，BP=43)，其他種群的支持率都較高(PP>0.6，BP>50)。云南洞密蛛的6個種群分化為6個相互獨立的地理譜系，第1支為BY，第2支為SLD，第3支為QX，第4支為XR，第5支為YLD，第6支為GN(圖2)。

圖2 基于6個云南洞密蛛種群COⅠ基因構建的貝葉斯樹Fig. 2 Bayes inference tree based on COⅠgenes from 6 Trogloneta yunnanense populations

2.5 云南洞密蛛種群歷史動態分析

使用中性檢驗和核苷酸錯配分布檢驗并推測云南洞密蛛的種群歷史動態。中性檢驗結果顯示Tajima’值為2.23(=0.941)，Fu’s值為7.512(=0.995)。核苷酸錯配分布圖顯示(圖3)，觀測值呈多峰分布，與期望值不符。

圖3 云南洞密蛛的錯配分布圖Fig. 3 Mismatch distribution test of Trogloneta yunnanense

3 討論與結論

迄今為止，云南洞密蛛的分布記錄僅來自云貴高原的8個地下洞穴(宋大祥，朱明生，1994；Lin & Li，2008；Li & Lin，2019)，目前未發現在地表有分布。

3.1 云南洞密蛛的遺傳多樣性與種群分化

云南洞密蛛的遺傳多樣性總體上較高，但各種群內的遺傳多樣性較低。6個種群間高遺傳分化指數、不存在共享單倍型和低基因流表明，云南洞密蛛在洞穴之間沒有發生遷移，6個種群間的 Nm值總體為0.01，幾乎不存在基因交流，形成各自獨立演化的“島嶼”種群。這與Snowman等(2010)對洞穴類球蛛遺傳結構的研究結果相似。種群間高度分化、種群內序列相似性較高的模式，與破碎生境下的種群模型預期結果一致(Hedin，1997)。受困于洞穴中的種群個體無法與外界交流，導致各洞穴種群進一步的遺傳分化(Snowman.，2010)。由于封閉的洞穴環境的特殊性和相對較小的種群規模，洞穴動物群可能形成極端的遺傳結構(Hedin，1997)。

系統發育分析表明，云南洞密蛛不同地理種群的單系性支持良好，6個種群遺傳分化明顯。在地理上相鄰的地區觀察到高度分化的譜系，這表明“島嶼”化的溶洞限制了種群間個體的遷移。從云貴高原整個地理區域來看，該物種的6個譜系并未表現出明顯的地理分布格局。云南洞密蛛種群的地理分布可能與洞穴隔離有關，而與地表的地理距離無關。另外，本研究僅使用基因作為遺傳標記，如果使用更多的基因序列，可能會得到更理想的結果。

3.2 云南洞密蛛的種群歷史動態

本研究中使用Tajima’、Fu’s2種中性檢驗方法和核苷酸錯配分布檢驗，推測了云南洞密蛛種群歷史動態。2種中性檢驗結果均為正值，且值不顯著，這與核苷酸錯配分布檢驗結果相符，表明云南洞密蛛自進入洞穴拓殖適應之后，未經歷過種群擴張，群體大小保持穩定。推測造成這一歷史動態的原因可能是，互不連通的洞穴系統將多洞穴分布的物種切割成為各自獨立的“島嶼”種群，這種地理阻隔促進了物種種群間的遺傳分化；與此同時，由于相對封閉的黑暗洞穴中的環境條件極端穩定，云南洞密蛛無法實現種群擴張。

3.3 云貴高原地下洞穴的物種形成

云貴高原位于中國地勢的第二階梯，受青藏高原造山運動的影響，氣候復雜多變。Ballarin和Li(2018)的研究發現，在云貴高原范圍內分布的小類球蛛屬大多為洞穴類群，根據分化時間推斷，其起源于始新世末期的地表，中新世的氣候變冷促使小類球蛛遷入地下洞穴避難并定殖。體型更小的云南洞密蛛目前已知僅在洞穴中有分布，其地下棲息生境與小類球蛛相似。猜測它可能與小類球蛛有著相似的演化適應模式，不同的是它的地表種群可能已經絕滅，只有地下離散分布的洞穴種群得以保留，因洞穴“島嶼”隔離效應，阻斷了該物種種群之間的基因交流，各種群的基因突變累積增加了整體的遺傳多樣性。

云南洞密蛛種群間高水平的分化程度支持Barr(1968)的假說：在洞穴殖民過程中，在初創事件之后，多樣性會減少，隨著一個物種在新的空白的地下生境拓殖定居，拓展了其種群在各自洞內的分布范圍，通過長時間的演化，可累積增加遺傳多樣性，同時洞穴隔離和極端的生境條件會加大不同地理種群的遺傳分化，有利于種群加速分化，最終形成新物種。

感謝西華師范大學的李云春博士在野外幫助采集樣本，四川大學生命科學學院的李亞和何懌婷在野外工作和樣本鑒定方面提供的幫助。