對葉榕果實對蘇卡達陸龜糞便微生物的影響

張笑穎， 鄒潔建， 肖嘉杰， 陸宇燕， 李丕鵬， 古河祥， 楊光大， 侯方暉， 王雪謙

(1. 沈陽師范大學兩棲爬行動物研究所，沈陽110034； 2. 廣東省野生動物監測救護中心，廣州510000；3. 沈陽市兒童醫院，沈陽110033)

腸道微生物菌群結構在對宿主的營養攝入、疾病發生、免疫力調節等方面的作用已被學術界廣泛認可，并成為近10年來的研究熱點(高權新等，2010；Hill & Artis, 2010；周建設等，2018)。影響腸道菌群組成結構的因素有3個：遺傳、生存環境和飲食(張家超，2014)。趙佩華(2016)指出，遺傳因素決定了菌群的組成成分，即有無的問題，而環境和飲食則對菌群各組成成分的數量起重要作用。腸道菌群對飲食組分變化的響應極其快速，并在飲食穩定后趨于動態平衡(David.，2014；張晶等，2015)。但這方面的研究目前集中在哺乳動物，尤其是人類。爬行動物腸道微生物對飲食變化的響應僅見對分布在不同飼養場鱷蜥泄殖腔樣本的研究，分別投喂蚯蚓和泥鰍的2組樣本的腸道菌群存在顯著差異(Jiang.，2017)。

蘇卡達陸龜是中非陸龜屬唯一種，分布于非洲中部，是世界第三大陸龜，常棲息于沙漠周邊或熱帶草原等開闊干燥地帶。雜食性，以植物為主要食物。人工飼養條件下喜食各種瓜果、蔬菜、牧草、桑葉等，可投喂少量牛肉、黃粉蟲等動物性食物(周婷，周峰婷，2020)。對葉榕為桑科Moraceace榕屬聚果榕亞屬subgen.植物，葉和花序內含有多種化學成分，其中花序含有β-欖香烯、β-芹子烯和α-依蘭油烯等(朱兆云，韋群輝，2010)。本文對1組體長相近的蘇卡達陸龜自主取食對葉榕果實前后的糞便樣本進行了16S rRNA高通量測序分析，旨在探究不同飲食組成成分對糞便微生物菌群結構的影響，并對其進行了功能預測的分析。旨在為蘇卡達陸龜糞便菌群多樣性研究積累科學資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及樣品采集

本實驗在廣東省野生動物監測救護中心完成，選取在中心飼養半年以上的7只蘇卡達陸龜，體長10～20 cm，日常以龜飼料(主要原料為魚粉、植物蛋白、維生素等)和應季蔬果(番薯藤、油麥菜var.、闊葉豐花草、番木瓜、南瓜等)投喂。在對葉榕果實成熟高峰期，飼養區內有大量的果實落入，蘇卡達陸龜會自由取食。觀察糞便發現，其中含有大量對葉榕種子。在果實成熟高峰期采集含有種子的糞便樣本(ZZ-A組)保存待檢測。在果實成熟后期，及時清理果實，常規飼養。在停止進食果實近2個月后，再次采集糞便樣本作為對照組(ZC-A組)。采樣時僅選取新鮮糞便中心部分以保證樣本質量。將樣本快速置于滅菌離心管內，-20 ℃保存，送上海派森諾生物科技股份有限公司檢測。共采集2組 14份樣品(表1)。

表1 采集樣品編號Table 1 Number of collected samples

1.2 微生物多樣性分析

使用Illumina公司NovaSeqPE250測序平臺進行16S rRNA測序。1.2%瓊脂糖凝膠電泳對樣品DNA進行檢測與質量提取。采用Nanodrop紫外定量設備進行紫外分光光度檢測。選擇rRNA基因可變區V3～V4基因片段進行PCR擴增，采用NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶。PCR引物序列為：正向引物5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’，反向引物3’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-5’。擴增體系25 μL：5 μL 5×反應緩沖液，5 μL 5×GC緩沖液，2 μL 2.5 mmol·LdNTP，1 μL 10 μmol·L正向引物，1 μL 10 μmol·L反向引物，2 μL DNA模板，8.75 μL ddHO和0.25 μL Q5 DNA聚合酶。擴增參數為：98 ℃ 5 min;98 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，25個循環;72 ℃ 5 min，10 ℃保持。

采用QIIME2(2019.4)完成序列質控、去噪、聚類等步驟以及多樣性分析。應用Alpha多樣性方法，通過Chao1、Observed species、Shannon、Simpson等4個指標分析樣本物種多樣性和豐富度；使用Beta多樣性分析，通過基于weighted UniFrac的距離生成的主坐標分析和基于bray_curtis距離生成的層次聚類分析評價樣本組間差異。利用Python LEfSe包等進行LEfSe分析，尋找分組之間穩健的差異物種即標志物種。采用Excel初步整理數據，SPSS判斷部分數據的方差齊性并進行差異性檢驗。菌群名稱和分類參考生物醫藥大辭典(https://lpsn.dsmz.de/)。

2 結果

2.1 微生物組成和結構特征

通過QIIME2對糞便樣本進行了測序分析，稀疏曲線顯示了ZZ-A組在測序深度為25 000時序列數基本穩定，ZC-A組在測序深度為15 000時序列數基本穩定，表明測序的數量已經飽和，可以真實反映樣本菌群組成情況(圖1：A)。檢測樣品獲得了平均長度為419.36 bp的842 940個高質量序列，以100%相似度聚類得到擴增序列變體(amplicon sequence variants，ASVs)，2組樣本共享1 187個ASVs，ZZ-A組獨有6 974個，ZC-A組獨有7 374個(圖1：B)。

圖1 蘇卡達陸龜糞便微生物的稀疏曲線圖(A)和ASV韋恩圖(B)Fig. 1 Rarefaction curve (A) and ASVs venn diagram (B) of Centrochelys sulcata fecal microorganisms

全部樣本檢測到并注釋的微生物共包含 39門，2組中相對豐度均>1%的菌門共有6個：擬桿菌門Bacteroidetes、厚壁菌門Firmicutes、變形菌門Proteobacteria、互養菌門Synergistetes、疣微菌門Verrucomicrobia和螺旋體門Spirochaetes，其中擬桿菌門和厚壁菌門為優勢菌門，兩者相對豐度之和分別為ZZ-A組89.55%、ZC-A組77.15%(圖2)。2組間6門的相對豐度均無顯著性差異，ZZ-A組擬桿菌門和螺旋體門的相對豐度高于ZC-A組，其余4個菌門則反之。厚壁菌門與擬桿菌門的比值(F/B)：ZZ-A組為0.42，ZC-A組為0.96，組間差異顯著(=0.047)。

圖2 蘇卡達陸龜糞便微生物門水平排名前10門的相對豐度Fig. 2 Relative abundance of top 10 fecal microbial phylum levels in Centrochelys sulcata

屬級水平分析結果顯示，所檢測標本中完成匹配的菌屬共有409個，相對豐度排名50位以后的菌屬以及未分類物種占比極高，2組均超過75%。相對豐度>1%的菌屬，ZZ-A組有3個：梭菌屬、密螺旋體屬和擬桿菌屬，它們的平均相對豐度均高于ZC-A組，其中擬桿菌屬的組間差異顯著(=0.03);ZC-A組有5個:普雷沃氏菌屬、氨基酸球菌屬、菌屬、菌屬和密螺旋體屬，前 4個菌屬的平均相對豐度均高于ZZ-A組，且均有顯著性差異(普雷沃氏菌屬：=0.02，氨基酸球菌屬:=0.04,菌屬:=0.02,菌屬:=0.007)。

2.2 微生物多樣性分析及其差異

Alpha多樣性統計顯示，2組樣本在Chao1(=0064)、Observed species(=0570)、Shannon(=0570)及Simpson(=0480)4個指數上均無顯著性差異(圖3)。基于weighted UniFrac的距離生成的主坐標分析顯示：ZZ-A組中 5個樣本和ZC-A組相互分離，另外有 2個樣本與本組相距較遠，而與ZC-A組相近(圖4：A)。提示提供這 2個糞便樣本的龜可能由于某些原因在進食對葉榕果實的頻度或數量上與其他龜存在一定的差別。基于bray_curtis距離生成的層次聚類分析顯示，2組樣本各自聚集在一起，呈現出良好的區分(圖4：B)。

圖3 蘇卡達陸龜糞便微生物Alpha多樣性分析Fig. 3 Alpha diversity analysis of Centrochelys sulcata fecal microorganisms

圖4 蘇卡達陸龜糞便微生物的主坐標分析圖(A)和層次聚類樹(B)Fig. 4 Principal co-ordinate analysis (A) and hierarchical clustering tree (B) of Centrochelys sulcata fecal microorganisms

LEfSe分析結果顯示，在互養菌門、疣微菌門、變形菌門中僅含有ZC-A組的標志物種，包括互養菌門的Synergistaceae菌科、疣微菌門的RFP12菌科、變形菌門的Betaproteobacteria綱；在擬桿菌門和厚壁菌門中，2組樣本的標志物種不同：ZZ-A組以擬桿菌門的擬桿菌目Bacteroidales、厚壁菌門的梭菌屬為標志物種，ZC-A組以擬桿菌門的理研菌科Rikenellaceae、普雷沃氏菌屬和菌屬，厚壁菌門的Lactobacillales菌目、Mogibacteriaceae菌科、瘤胃球菌科Ruminococcaceae和菌屬為標志物種(圖5)。

圖5 蘇卡達陸龜糞便微生物LEfSe分析的分類學分支圖Fig. 5 Cladogram of Centrochelys sulcata fecal microorganisms based on LEfSe analysis

2.3 功能預測分析

將2組糞便微生物菌群的ASVs與KEGG數據庫核心生物代謝通路分析數據進行對比，注釋后得到的KEGG代謝通路預測結果顯示：共涉及6條一級生物代謝通路、33條二級代謝通路子功能以及181條三級代謝通路。在存在顯著性差異的14條三級代謝通路中，13條在相關功能的菌群相對豐度上呈現為：ZZ-A組>ZC-A組(表2)。其中，四環素的生物合成、聚酮體糖單元的生物合成和乙基苯的降解代謝通路在ZC-A組的豐度值為0，而在ZZ-A組最高可達338.96，在雙酚的降解、阿特拉津的降解和多環芳烴的降解和甜菜素的生物合成代謝通路中，ZZ-A組均高出ZC-A組 5倍以上。

表2 組間存在顯著性差異的代謝通路Table 2 Metabolic pathways that differed significantly between groups

3 討論

3.1 糞便微生物多樣性的變化

由于食物表面攜帶有未知菌群以及食物所含物質及其在機體中代謝產生的物質均對腸道菌群有著不可忽略的作用，因此食物組分的改變對腸道菌群結構的改變備受關注(韓翔宇等，2021)。觀察投喂不同飼料的草魚發現，腸道菌群在改變飼料組成的初期出現顯著變化，且在11 d后菌群結構達到新的動態平衡(郝耀彤等，2015)。在以豆粕替代魚粉喂養牛蛙()和分別喂食蚯蚓和泥鰍的鱷蜥的研究表明，飲食的改變可以使腸道菌群的豐度發生變化(Jiang.，2017；丁李，2019)。本研究中ZZ-A組和ZC-A組的菌群結構也發生了明顯變化，2組取材時間僅間隔了2個月左右，證明了蘇卡達陸龜腸道菌群結構對食物組分變化具有快速調整的能力。

3.2 糞便微生物功能預測

生活環境中，無論是空氣、水域、土壤中，還是食物表面均有大量的菌群存在，它們隨著飲水和進食進入胃腸道，并在其中生長繁殖，它們自身及其代謝產物不同程度地影響著有機體胃腸道的健康，甚至通過腦腸軸參與機體各個器官功能(趙軒等，2019)。對于進入胃腸道的菌群，按照它們對機體的影響可劃分為有益菌、致病菌和條件致病菌(臧海軍，張克英，2007)。一些細菌在代謝過程中可以產生短鏈脂肪酸，尤其是丁酸及丁酸鹽類物質對保持腸道黏膜上皮細胞結構和功能有不可忽視的貢獻，同時也是腸道上皮的主要能量來源之一(張家超，2014)。而更有研究證明腸道菌群的健康與人體的肥胖、心腦血管疾病甚至是中樞神經疾病均有密切的關聯(李莎等，2021)。另外，由于工業和農業生產的需要，一些具有“三致”特性的物質，如乙基苯和多環芳烴，一些具有“環境類激素”的物質，如雙酚類和阿特拉津等在環境中超標，嚴重影響了有機體的健康(王小存，2007；張海峰，2007；董靜等，2021；曾超怡等，2021)。機體內部的氧化和抗氧化平衡是維護細胞健康和功能正常的關鍵，但由于環境污染和藥物使用量的不適當以及各種生理和心理的失調，均會增加機體內部自由基，影響氧化和抗氧化平衡的維持，繼而造成細胞受損和加速衰老進程(李晨等，2021)。

本研究的功能預測結果發現，主動進食了對葉榕果實的蘇卡達陸龜糞便菌群在四環素的生物合成、聚酮體糖單元的生物合成、乙基苯的降解、雙酚的降解、阿特拉津的降解和多環芳烴的降解以及甜菜素的生物合成等代謝通路上的富集呈現出了與對照組極顯著的差異，個別甚至是從無到有(四環素的生物合成、聚酮體糖單元的生物合成、乙基苯的降解)。但是這些代謝通路的富集原因以及是否可以表達相關功能進而產生相應的生理效應還需要深入研究。

感謝廣東省野生動物監測救護中心徐錦興、毛學群、成鑒榮和梁穎琳在動物飼養和取材中的幫助。