基于激發態分子內質子轉移的新型聚集誘導熒光探針用于硫化氫的檢測及細胞成像

劉芙蓉，閆 麗，范哲鋒，溫曉燁

（山西師范大學 化學與材料科學學院，山西 太原 030006）

硫化氫（H2S）主要以水溶液形式（HS-）存在，并以其刺激性氣味和有害特性受到關注。生物系統中的H2S已被公認為是第三種內源性氣體遞質［1-2］，有助于維持細胞健康的多種生理過程，如參與血紅蛋白的變化、調節酶的種類、舒張血管等［3-4］；但H2S 的異常積累也可能導致某些疾病，如阿爾茨海默病、肝病、糖尿病等［5］。另一方面，食品工業中，如發酵過程產生的H2S 對葡萄酒的品質有負面影響，不僅造成了大量經濟損失，甚至會危害人體健康［6］。因此，設計和開發新穎有效的方法來檢測和跟蹤生物系統和食品材料中的H2S具有重要意義。

目前已報道了多種H2S 的檢測方法，如電化學法、氣相色譜法、比色法、化學發光法（CL）和熒光法［7-10］，但存在樣品制備相對復雜、操作時間長等缺點。研究者們基于熒光檢測的優勢，根據親核加成反應、羥胺、硝基或疊氮化物的還原以及Cu2+置換等不同機理，設計了多種檢測H2S 的熒光探針［11-12］。然而多數探針存在其他生物硫化物的干擾以及聚集誘導猝滅（ACQ）等缺陷，限制了其實際應用。因此，設計具有良好性能的H2S 熒光探針（例如可應用于水溶液介質，克服光漂白的影響等）具有重要意義。2001 年，Tang 課題組提出了聚集誘導發射（AIE）的概念［13-14］，相對于傳統的ACQ 分子，AIE 分子因具有高抗光漂白性、發射波長可調、可長期實時監測等獨特的光物理特性，廣泛應用于生物系統和食品材料［15-16］。

本文使用4-乙酰氨基苯甲醛和碳酸肼合成了一種具有AIE 特性的高效新型熒光探針1 用于檢測H2S。從探針分子結構（圖1）分析，探針的AIE特性可能歸因于激發態分子內質子轉移（ESIPT）效應和分子內旋轉受限（RIR）效應。進一步研究表明，探針1+Cu2+對H2S 具有高時效、高靈敏的傳感性能，由此成功構建了快速靈敏的開啟型H2S熒光探針，并將其成功應用于酒液樣品中的H2S檢測以及活細胞中外源性H2S的生物熒光成像。另外，利用探針1制備了實時有效的H2S視覺傳感器，并將其用于構建具有熒光強度差異的超靈敏邏輯門。本研究為設計應用于檢測氣體或小分子的新型AIE 熒光材料提供了新思路。

圖1 探針1的檢測機理示意圖Fig.1 Proposed detection principle for the probe 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

質譜數據由高分辨率質譜（HRMS）儀器Ultra flex TOF/TOF（德國布魯克）記錄，1H NMR 和13C NMR數據在ANAVCE III HD NMR 波譜儀（德國布魯克）上測得，熒光光譜由Cary Eclipse 分光光度計（美國珀金埃爾默）記錄，SEM 圖像由JSM-7500F 顯微鏡（日本電子）獲得，使用TU-1901 分光光度計（北京普析）記錄樣品的紫外吸收光譜。

4-乙酰氨基苯甲醛、碳酸肼、NaHS（作為H2S 的供體）購于阿拉丁化學試劑公司，乙醇、二甲基亞砜（DMSO）購于天津科密歐試劑有限公司。所有試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 合成過程

合成路線見圖2。將碳酰肼（5 mmol，0.45 g）和4-乙酰氨基苯甲醛（10 mmol，1.93 g）溶于乙醇（25 mL）中，加入幾滴乙酸作為催化劑，反應混合物在82 ℃下攪拌8 h。反應結束后冷卻，純化、蒸干，得到黃色固體顆粒（1.42 g，產率73%）。1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ（ppm）：δ10.36（s，1H），8.20（s，1H），7.33（s，1H），6.24（dd，J=8.8 Hz，1H），6.11（d，J=2.3 Hz，1H），3.34（dd，J=14.0 Hz，4H），1.11（t ，J= 7.0 Hz，6H）。13C NMR（400 MHz，CDCl3）δ（ppm）：δ150.04（s，1H），107.85（s，1H），104.01（s，1H），98.02（s，2H），40.48（d，J= 17.8 Hz，17H），13.03（s，4H）。HRMS（EI）：理論值［probe 1+H］+441.531，計算值441.275。

圖2 探針1的合成Fig.2 Synthesis route of the probe 1

1.3 測試方法

溶液配制：將探針1 溶解在二甲基亞砜（DMSO）中配制為儲備溶液（1.0 mmol/L）；NaHS（作為H2S的供體）用超純水溶解配制成10 mmol/L 的儲備溶液；其他競爭分析物如F-、Cl-、Br-、I-、S2-、CH3COO-、PO34-、OH-、ClO-、CO23-、HPO24-、HCO-3、谷胱甘肽（GSH）和同型半胱氨酸（Hcy）均在去離子水中制備為儲備液；使用時稀釋至所需濃度。

光譜測量：為探究探針1 的光物理性質，在DMSO 和水的混合溶劑（水的體積分數為0%～99%）中測試了探針的熒光光譜和紫外吸收光譜。除特別說明外，所有光譜測試均在DMSO-H2O（1∶9，體積比），pH 7.4（PBS，0.2 mol/L）的水性介質中進行（λex=370 nm，狹縫寬度：5 nm/15 nm）。

1.4 生物成像過程

利用共聚焦顯微鏡探究了探針1 在HeLa 細胞中外源性H2S 的檢測與生物熒光成像中的應用。首先在37 ℃，5%CO2條件下，于DMEM 培養基中接種HeLa 細胞并培養24 h，再將探針1 和探針1+Cu2+分別加入HeLa 細胞的DMEM 培養基中繼續培養1 h。將上述HeLa 細胞用PBS（pH 7.4）清洗3 次并進行熒光成像，在加入HS-（作為H2S的供體）后進一步使用PBS（pH 7.4）處理，再次進行熒光成像。

2 結果與討論

2.1 探針的光學特性

首先，在不同溶劑中測試了探針1 的熒光光譜，如圖3A所示，探針1 僅在含有10%DMSO的水溶液中顯示出很強的熒光發射。這是由于探針1僅溶于常見的有機溶劑，不良溶劑（水）會誘導其產生聚集，導致熒光增強。探針1 在不同比例的DMSO和水的混合溶劑中的熒光光譜顯示（圖3B），隨著混合溶劑中水體積分數的增加，探針1 在500 nm處的熒光強度逐漸增強，呈綠色熒光。當水的體積分數達到90%時，探針1的熒光強度最大，是其在純DMSO溶劑中熒光強度的60倍（圖3C），當水的體積分數超過90%時，熒光強度有所降低，可能的原因是當混合溶劑中水的含量比較高時，導致溶液聚集成較大的顆粒使熒光強度有所降低。以上結果均說明探針1表現出良好的AIE特性。

圖3 探針1在不同有機溶劑中（A）及在不同比例的DMSO和水的混合溶劑中（B）的熒光光譜；探針1在DMSO中的發射強度與H2O體積分數（%）的函數關系（C）Fig.3 The fluorescence spectra of the probe 1 in different organic solvents（A）and in mixed solvent with different ratios of DMSO and water（B）；the emission intensity of the probe 1 in DMSO as a function of H2O（%）（C）inset：the fluorescence photograph by a 365 nm UV lamp

以硫酸奎寧（0.1 mol/L 硫酸溶液，ΦF=0.56）為參照物，測量了探針1 在純DMSO 溶劑和混合溶劑DMSO-H2O（1∶9）中的量子產率，基于以下公式進行計算：Φx=Φst（Ix/Ist）（η2x/η2st）（Ast/Ix）（x、st分別為被測物質和參照物；Φ、I、A、η分別為量子產率、熒光積分面積、吸光度和溶劑折射率）。結果表明，探針在混合溶劑DMSO-H2O（1∶9）溶液中的相對量子產率（0.532）明顯高于純DMSO（0.065）。

通過掃描電子顯微鏡對探針的形貌進行表征，如圖4 所示，隨著混合溶劑中水體積分數的增加，探針1的形態從片狀變為堆疊簇狀，這表明不良溶劑（水）誘導探針發生聚集，導致熒光增強。探針1的分散粒徑圖也證實了其AIE 特性，如圖5A 所示，純DMSO 中探針的粒徑非常小，然而隨著水體積分數的增加其粒徑顯著增大，這說明探針1發生了聚集。

圖4 探針1（20 μmol/L）在不同混合溶劑中的SEM形貌圖像Fig.4 SEM images of the probe 1（20 μmol/L）in different mixed solvent A-C：water content were 0%，50%，99%，respectively

圖5 探針1在純DMSO和混合溶劑（DMSO-H2O，1∶9）中的DLS分析（A）；探針1在水溶液中的電子云軌道圖（B）；探針1在不同有機溶劑中的紫外吸收光譜（C）Fig.5 The DLS analysis of the probe 1 in pure DMSO and in mixed solvent（DMSO-H2O，1∶9）（A）；the electronic cloud orbital diagrams of the probe 1 in aqueous solution（B）；the UV absorption spectra of the probe 1 in different organic solvents（C）

從探針分子結構分析，探針的AIE 特性可能歸因于ESIPT 和RIR 效應。探針分子本身具有高度平面的剛性結構，在DMSO-H2O（1∶9）混合溶劑中，探針中的鄰羥基和羰基分別作為供體和受體形成氫鍵［17-18］，一方面激活了ESIPT［19］；另一方面，探針1 的剛性和π 共軛進一步增強，探針分子旋轉受限，無輻射消耗能量，熒光增強。

為進一步探究探針AIE 特性的發光機理，采用Gaussian 09 程序包，使用B3LYP/6-31G 基組基于DFT 計算方法對探針1 和探針1 + Cu2+進行結構優化。結果顯示（圖5B）探針1 中最高占據分子軌道（HOMO）的電子密度位于苯環和乙氨基上，最低未占據分子軌道（LUMO）的電子云位于水楊醛和碳酰肼上，這說明鄰羥基和苯基與亞氨基部分的吸電子作用導致分子內電荷從苯乙胺基團轉移到鄰羥基和苯基。電子云密度的這種變化與探針1 的紫外吸收光譜（圖5C）變化一致，即探針1 在DMSO-H2O（1∶9）混合溶劑中的吸收峰相較于純有機溶劑中明顯減弱，這歸因于分子聚集態光散射。

2.2 探針1+Cu2+對H2S的傳感性能及機理研究

探針1是典型的席夫堿化合物，含有N、C和O 等結合位點，是潛在的金屬離子螯合劑［20］。通過光譜測試觀察探針1與各種金屬離子的結合情況（圖6A），發現探針1（20 μmol/L）的熒光僅能被Cu2+猝滅。隨著Cu2+濃度的增加，探針1 的熒光強度逐漸減弱并在Cu2+濃度為20 μmol/L 時達到熒光猝滅平衡（圖6B），表明探針1 與Cu2+的結合比例為1∶1，猝滅率為85%，這說明探針1 能選擇性地與Cu2+絡合。通過等摩爾連續變化法（Job's-Plot）（圖6B 插圖上圖）進一步證明了探針1 與Cu2+以1∶1 的方式配位結合。從1H NMR 譜（圖7）可以推測其結合機理：探針1 在水溶液中易形成氫鍵，激發ESIPT 效應使其結構剛性增強，熒光發射增強。加入Cu2+后，探針1 與Cu2+結合，羥基的H1（10.37）消失，胺的H2 向高場移動，苯環對應的7.33 ～6.11 處的氫有小幅移動，表明羥基和胺基的氮原子參與了與Cu2+的結合，導致分子內氫鍵破壞，限制了ESIPT 過程從而使熒光猝滅。再添加HS-后，Cu2+與HS-具有更強的結合力，使H2又移回低場，ESIPT效應重新恢復，熒光發射恢復增強。

圖6 在PBS緩沖溶液中加入各種離子后探針1的熒光光譜（A）；添加Cu2+離子后探針1的熒光“關閉”（B）；探針1、探針1+Cu2+、探針1+Cu2++HS-在PBS緩沖溶液中的熒光光譜（C）Fig.6 Fluorescence spectra of probe 1 after adding various ions in PBS buffer solution（A）；fluorescence“turn off”of the probe 1 with the addition of Cu2+ion（B）；the fluorescence spectra of the probe 1，the probe 1+Cu2+，the probe 1+Cu2++HS-in PBS buffer solution（C）inset C：the fluorescence change by a 365 nm UV lamp

圖7 探針1、探針1+Cu2+、探針1+Cu2++HS-在DMSO-D6中的1H NMR分析Fig.7 The1H NMR spectra analysis of the probe 1，the probe 1+Cu2+，the probe 1+Cu2++HS-in DMSO-D6

在PBS（pH 7.4）-DMSO（體積比9∶1）中，探針1（20 μmol/L）可發出亮綠色熒光，加入等量Cu2+后，熒光幾乎被猝滅。進一步加入HS-，熒光強度明顯恢復增強。在365 nm 紫外燈下可以清楚地觀察到探針1的熒光變化（圖6C）。此外，在相同條件下添加200 μmol/L 的其它競爭分析物（HS-、F-、Cl-、Br-、I-、S2-、CH3COO-、PO34-、OH-、ClO-、CO23-、HPO24-、HCO-3、SO23-、HSO-3、GSH、Hcy），體系熒光幾乎沒有變化，只有添加HS-后熒光強度明顯增強，表明探針1 + Cu2+對HS-具有高度選擇性（圖8A）。當存在其它競爭分析物時，添加特定量的HS-仍然使得探針熒光增強，證實探針1 具有優良的抗干擾性（圖8B）。值得注意的是，I-的存在并不干擾檢測，這可能是因為CuS的KS（P沉淀平衡常數）小于CuI的KSP［21］。

圖8 在PBS緩沖溶液中加入各種競爭分析物后探針1+Cu2+的熒光光譜（A）；依次添加各種相關競爭分析物以及HS-后探針1+Cu2+在PBS溶液中的發射強度變化（B）Fig.8 The fluorescence spectra of the probe 1+Cu2+with addition of various competitive analytes in PBS buffer solution（A）；emission strength changes of the probe 1+Cu2+in PBS solution with sequential adding various relevant competitive analytes and HS-（B）

2.3 探針1+Cu2+對HS-的熒光響應

在PBS（pH 7.4）-DMSO（體積比9∶1）體系中，加入等體積不同濃度的HS-，進行探針1 + Cu2+（20 μmol/L）的熒光滴定實驗（圖9）。結果顯示隨著HS-濃度的增加，探針1+Cu2+的熒光強度在HS-濃度0～25 μmol/L 內呈線性增強，線性方程為y=23.32x+99.77，相關系數r2=0.991 8。根據公式D=3σ/k計算得到檢出限為0.27 μmol/L。值得一提的是，將HS-加入探針1+Cu2+后，在30 s 內500 nm 處的熒光強度逐漸增強并趨于穩定，說明探針1 具有快速實時靈敏檢測HS-的優勢。目前能夠快速實時檢測H2S的熒光探針鮮少報道（表1）。

表1 與檢測H2S 的其他熒光探針的比較Table 1 Comparison of other probes for H2S detection

2.4 實際應用

2.4.1 H2S 實時檢測試紙的制備基于探針1 對H2S 的快速靈敏檢測，制備了簡單、便攜、經濟的檢測試紙。將空白濾紙浸泡在探針1 + Cu2+（0.2 mmol/L）的PBS（pH 7.4）-DMSO（體積比9∶1）溶液中，在室溫下自然干燥，然后浸泡在含有不同濃度H2S（0、 0.05、 0.10、 0.15、 0.20、 0.30、 0.40、0.50 mmol/L）的溶液中。隨著H2S 濃度的增加，在365 nm 紫外燈下，觀察到檢測試紙熒光明顯從無色（由于白色濾紙在紫外燈照射下而呈現藍色）變為綠色（圖9）?；诖朔椒?，通過熒光圖像和智能電子設備掃描，可制造視覺傳感器并用于H2S的實時在線高效檢測。

圖9 基于探針1的H2S檢測試紙的熒光圖片Fig.9 The fluorescence photo of the filter paper based the probe 1 to detect H2S

2.4.2 探針1 + Cu2+檢測實際酒液樣品中的H2S據報道，H2S 不僅會影響白酒質量，甚至會導致白酒變質。采用探針1檢測酒中的H2S濃度。酒液樣品從臨汾便利店購買。將樣品稀釋100倍，即可制備DMSO-酒（1∶9，體積比）溶液。將探針1+Cu2+添加到處理過的實際樣品中，添加不同濃度的H2S（分別為0、5.00、10.00 μmol/L）。如表2所示，所有樣品中均檢測到H2S，包括白酒（1.24 μmol/L）、蘋果酒（5.05 μmol/L）、啤酒（1.73 μmol/L）。根據標準回收方法，3 種樣品的回收率為95.2%～113%，表明探針1可用于實際酒液樣品中H2S的檢測。

表2 白酒、蘋果酒和啤酒中H2S含量的測定Table 2 Detection of H2S levels in spirit，cider and beer

2.4.3 生物熒光成像首先，通過3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）實驗評估探針1的細胞毒性。以正常細胞為對照，將探針1與細胞孵育20 h以上，細胞存活率超過85%，表明探針1對細胞的毒性非常低，可進一步用于細胞成像。HeLa細胞與探針1（50 μmol/L）孵育1 h后，在共聚焦顯微鏡下呈現亮綠色熒光。將上述HeLa 細胞立即與Cu2+（50 μmol/L）孵育1 h，細胞內熒光消失，表明探針1的熒光強度因探針1與Cu2+的結合而猝滅。為檢測細胞內的H2S，在上述細胞中加入50 μmol/L HS-，于顯微鏡下觀察到亮綠色的細胞內熒光（圖10）。由于生物體內的內源性H2S 均來源于半胱氨酸蛋白水解酶或其衍生物，因此將生物硫醇抑制劑N-乙基馬來酰亞胺（NEM，50 μmol/L）加入上述細胞中作為對照，結果發現細胞熒光消失，進一步證實細胞內的硫醇被NEM 抑制和破壞。以上結果表明探針1可以選擇性地檢測細胞中的外源性硫化氫。

圖10 活HeLa細胞與探針1（A）、探針1+Cu2+（B）、探針1+Cu2++HS-（C）、探針1+Cu2++HS-+NEM（D）的熒光成像Fig.10 The fluorescence imaging of living HeLa cells incubated with the probe 1（A），the probe 1+Cu2+（B），the probe 1+Cu2++HS-（C），the probe 1+Cu2++HS-+NEM（D）light field images（a，d，g，j）；fluorescence images（b，e，h，k）；overlay images（c，f，i，l）

2.5 邏輯門的設計與應用

基于探針1 檢測H2S 的優越性，將探針1 應用于邏輯門領域。設置兩個輸入信號：H2S（input 1）和HSO-3/SO2-3/S2-（input 2），探針1 在500 nm 處的熒光信號被定義為輸出信號。共進行4 種不同的設置（圖11）：H2S 存在（賦值1），但HSO-3/SO2-3/S2-不存在（賦值0）；H2S 存在，HSO-3/SO2-3/S2-存在；H2S 不存在，HSO-3/SO2-3/S2-不存在；H2S 不存在，HSO-3/SO2-3/S2-存在。當（input 1，input 2）為（1，0），（1，1）時，550 nm 處的輸出發射強度為“1”；當（input 1，input 2）為（0，1），（0，0）時，550 nm 處的輸出發射強度為“0”，說明H2S是唯一能激活探針1熒光發射的因素。

圖11 探針1+Cu2+加入S2-、SO23 -、HSO-3、H2S后的熒光光譜（A）；兩個輸入系統的邏輯門行為（B）；邏輯門的真值表（C）Fig.11 The fluorescence spectra of the probe 1+Cu2+upon addition of S2-，SO2 -3 ，HSO-3，H2S（A）；logic gate behavior from two input systems for constructed（B）；the truth table for the logic gate（C）

3 結 論

本文基于聚集誘導熒光增強以及ESIPT 效應設計了一種新型活性探針1，并將其用于H2S的高靈敏度、選擇性檢測。首先對探針1 的光化學性質及其發光機理進行了詳盡地討論，并將該探針成功應用于酒液樣品中H2S 以及活HeLa 細胞中外源性H2S 的檢測，同時將其用于構建邏輯門。基于探針的靈敏性，設計了簡單便攜的H2S檢測試紙。該研究為設計基于AIE的新型氣體分子傳感器提供了新思路。