基于非接觸電導檢測和在線富集技術快速靈敏檢測土壤中速效磷

齊培杉，朱蓬生，謝天堯

（中山大學 化學學院，廣東 廣州 510275）

磷是植物生長過程中的重要元素之一。若缺磷，植被則難以生長，而磷含量過多也會造成磷污染。土壤含磷量（包括有機磷和無機磷）的多少及其存在形態(tài)常與生長在該區(qū)域的植物生長發(fā)育狀況有著重要聯(lián)系［1-3］。通常有機磷因以高分子形態(tài)存在，難以直接被植物吸收作為養(yǎng)分；而無機磷則包括了與鈣、鐵、鋁等絡合的難溶性磷酸鹽以及能夠為植物吸收利用的水溶性無機磷酸鹽。由于水溶性無機磷可為植物直接吸收利用（稱之為速效磷），因此其含量是反映土壤中速效磷的重要指標［4-5］。通過研究速效磷在土壤中的分布及含量，能夠深入了解土壤中磷的供應狀況，這對于農業(yè)中的精準施肥有直接的指導意義［6-8］。但在土壤中速效磷的研究過程中，由于其含量很低且土壤中大量共存組分的干擾嚴重，因此建立靈敏快速、抗干擾能力強的土壤中速效磷含量的檢測新方法具有十分重要的現(xiàn)實意義。

土壤中速效磷的常規(guī)檢測方法是采用浸提劑浸出土壤中的可溶性磷，再用比色法進行檢測［4-5］。其它有關磷的分析方法主要有：離子色譜法、毛細管電泳法、電化學分析法和光學分析法等［9-14］。其中，比色法的步驟較繁瑣，檢測時間長，檢測靈敏度低。此外，因土壤中含有一定量的有機質，浸出液通常呈深淺不一的黃褐色（須用活性炭脫色后再測定），一定程度上對比色分析造成了干擾。浸出液的顏色也會不同程度地影響到其它光學分析方法。離子色譜法是較廣應用于土壤和水體中無機陰離子測定的分析方法，但存在前處理復雜，色譜柱較昂貴且易污染，分析成本高和不適于現(xiàn)場快速檢測的缺點。根據(jù)已有研究，建立操作簡單且快速靈敏的分離檢測土壤中速效磷新方法，尚屬一個具有挑戰(zhàn)性的研究課題。毛細管電泳法（CE）具有高效、分離速度快，樣品和試劑消耗少，易于小型化和便攜化等特點。電容耦合非接觸電導檢測法（C4D）作為一種優(yōu)良的CE 通用檢測技術，對被檢測組分具有普適性，尤其在極弱光活性和電活性組分檢測中更顯優(yōu)勢。C4D 中溶液與電極之間因毛細管壁的間隔而不接觸，因而具備良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性［15］。場放大進樣（FASI）在眾多CE在線富集方法中操作最為簡單，且富集因子高，極具實際可操作性，進而很好地解決了常規(guī)CE在微量、痕量分析中靈敏度不足導致應用受限的問題［16］。FASI通常以超純水作為進樣介質（即樣品直接溶于超純水），通過電動進樣實現(xiàn)高效的在線富集效果［16-18］。因此，采用FASI-CE-C4D 測定土壤中速效磷含量，是極具應用潛力的檢測新技術。

本文采用FASI-CE-C4D 對土壤中速效磷的含量進行測定，通過優(yōu)化實驗條件使得土壤中共存的常見無機陰離子（如Cl-、SO24-、NO-3）和有機基質不干擾速效磷的測定；樣品無需進一步處理即可直接進樣分析，從而為土壤中速效磷的快速檢測提供了一種操作簡單、靈敏和成本低的檢測新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CES2018 型毛細管電泳儀、C4D 檢測器、C4D 檢測池體（廣州涵天科儀公司）；石英毛細管柱（邯鄲永年銳沛色譜器件公司）；TG16-WS型臺式高速離心機（湖南湘儀公司）。

乙酸（HAc）、乙酸銨、NaOH、HNO3、氯化鈉、硝酸鈉、硫酸鈉；十六烷基溴化銨（CTAB）、三羥甲基氨基甲烷（Tris，廣州化學試劑廠）；磷酸二氫鉀標準品（北京國家標準試劑公司）；土壤標準樣品（GBW07461，由廣東土壤研究所提供），所用試劑除注明外均為分析純。實驗用水為超純水，由超純水機制備。

用水、乙酸和乙酸銨直接配制電泳運行液，現(xiàn)用現(xiàn)配。用水和經105 ℃干燥2 h 的KH2PO4配制質量濃度為100 mg/L 的磷標準儲備液（若以PO3-4計，則為306.6 mg/L），保存在4 ℃冰箱；實驗時，取適量的上述標準品儲備液用水配成不同質量濃度的標準工作溶液。

1.2 實際樣品的處理

參照文獻方法［1-2］，土壤樣品經烘干、研磨后稱取0.500 0 g 加入10 mL 水浸泡。震蕩5 min 后超聲浸提5 min，經6 000 r/min 離心5 min 后靜置5 min。取適量上清液于進樣瓶中（如有必要，可經過濾處理），視實際樣品中磷含量用水稀釋至適當倍數(shù)，使其質量濃度處于線性檢測范圍之內，上機進行FASI-CE-C4D測定。

1.3 實驗方法

毛細管在使用前的處理參照文獻［17］：每2 次進樣分析之間，用運行液沖洗毛細管3 min，走基線8 min。電泳分析過程運行5 h后，電泳儀兩端的儲液瓶中需換新鮮電泳運行液。石英毛細管柱：45 cm×50 μm id，Leff=40 cm。35 mmol/L 乙酸+2 mmol/L 乙酸銨溶液為電泳運行液。CE 儀器的參數(shù)為：負高壓分離：-14 kV，電動進樣：-11 kV×10 s。C4D 檢測器的輸出信號由數(shù)據(jù)工作站實時采集到上位微機中進行CE-C4D電泳圖譜的記錄和分析。儀器運行條件為室溫，相對濕度≤70%。

2 結果與討論

2.1 CE分離條件的選擇

磷酸根離子在水溶液中以陰離子形式存在，采用負高壓的分離模式可獲得良好的分離效果［15］。電泳運行液對分離度、靈敏度、信噪比有著重要影響，通過選擇合適的運行液，能夠獲得最佳的分離度、靈敏度、信噪比和平穩(wěn)基線。土壤樣品中共存的氯離子、硫酸根離子、硝酸根離子是磷酸根離子檢測中最主要的干擾離子。因此，在電泳運行液的選擇方面主要考察Cl-、SO24-、NO-3、PO34-的分離情況。經對多種電泳運行液體系（HAc - NH4Ac、HAc-Tris、HAc-Tris-CTAB、HAc-NaOH、HAc-NaOH-CTAB）進行測試，結果表明：采用35 mmol/L 乙酸-2 mmol/L 乙酸銨溶液（pH 3.0）作為電泳運行液時，可以很好地滿足土壤樣品中磷酸根離子的分離檢測要求，其主要具有以下優(yōu)點：①此時該電泳運行液的pH 3.0 左右，石英毛細管壁上的硅羥基電離幾乎完全抑制，導致電滲流很小［19］，無需添加電滲流抑制劑，且基線平穩(wěn)。②在pH 3.0 的酸性介質中，磷酸根離子主要以磷酸二氫根離子形式存在［20］，是毛細管中電遷移的主體，因此進樣組分PO34-、HPO24-、H2PO-4均表現(xiàn)為具有相同電遷移時間的單峰，且峰形尖銳單一，磷酸根離子的檢測靈敏度高。③土壤中共存的常見無機陰離子（Cl-、SO24-、NO-3）不干擾磷的測定（見圖1）。因此本實驗選擇35 mmol/L 乙酸-2 mmol/L 乙酸銨溶液（pH 3.0）作為最佳電泳運行液。

圖1 Cl-、SO24 -、NO-3、PO34 -混合離子的FASICE-C4D 電泳譜圖Fig.1 FASI-CE-C4D electropherogram of the mixed Cl-，SO24 -，NO-3 and PO34 -ions running buffer：35 mmol/L acetic acid+2 mmol/L ammonium acetate（pH 3.0）；separation voltage：-14 kV，electrokinetic injection：-11 kV×10 s

2.2 分離電壓的選擇

考察了分離電壓的影響，實驗結果表明：隨著分離電壓由-8 kV 升至-18 kV，目標離子的出峰時間不斷縮短，有利于提高分析速度。但當分離電壓達到-16 kV以后，目標電泳峰與土壤中的干擾離子峰發(fā)生部分重疊，且電泳電流引起的焦耳熱也隨之增加，使得檢測結果的信噪比降低。綜合考慮分析時間、共存組分干擾情況以及基線穩(wěn)定性的影響，本文選擇-14 kV為最佳分離電壓。

2.3 場放大進樣條件的選擇

在FASI 中，需對進樣電壓和進樣時間進行優(yōu)化。實驗考察了目標電泳峰強度與進樣電壓間的關系。結果表明：當進樣電壓由-3 kV 調至-11 kV 時，目標峰的峰高隨之線性增加，而半峰寬變化不明顯；當進樣電壓超過-11 kV 后，峰高增加趨緩，而半峰寬則明顯增加。因此，從分離度方面考慮，本實驗采用進樣電壓為-11 kV。

考察了進樣時間由3 s增至15 s時，磷酸根離子的電泳峰峰高和半峰寬的變化情況。結果表明：進樣時間由2 s增至10 s時，峰高隨時間的增加而線性增加，當進樣時間超過10 s時，峰高隨時間變化趨緩，而峰寬則明顯增加。因此，選擇最佳進樣時間為10 s。

電動進樣前，通過重力進樣方式進5 s左右的水（稱之為水塞）可進一步提升磷酸根離子的檢測靈敏度（約提高50%）。但需指出水塞為非必要步驟，在靈敏度滿足實際樣品的檢測要求時可省略。本實驗省略了該步驟。

在上述實驗條件下，測定了FASI法對磷酸根離子的富集因子，結果表明：通過FASI，磷酸根離子的檢測靈敏度相比于常規(guī)進樣方法得到顯著提高，富集前后的譜圖對比如圖2 所示。圖2a 采用常規(guī)的重力進樣，磷酸根離子的進樣濃度為5.0 mg/L（樣品介質為水）；圖2b采用FASI進樣，磷酸根離子的進樣濃度為0.10 mg/L。通過計算得出富集因子為580。

圖2 PO34 -經常規(guī)重力進樣（a）和FASI進樣（b）的CE-C4D電泳譜圖Fig.2 CE-C4D electropherograms of PO34 -by normal hydrodynamic injection（5.0 mg/L）（a）and FASI（0.10 mg/L）（b）

2.4 干擾情況考察

土壤浸出液的基體相對較復雜，與磷酸根離子共存的組分主要有：無機陰離子Cl-、NO-3、SO2-4以及有機酸（如：草酸、甲酸、乙酸等）。但基于以下原因，這些基體物質不干擾測定結果（見圖3）：①選擇了合適的電泳運行液，使得主要的干擾組分Cl-、NO-3、SO2-4的電泳峰遠在磷酸根離子電泳峰之前，不影響土壤中速效磷的測定；②負高壓分離模式下，僅有陰離子組分遷移到檢測器被檢出，而陽離子因遷移方向相逆未檢出；③由于采用了乙酸電泳運行液，對于電離常數(shù)值接近或小于乙酸的有機弱酸，因電離幾乎被抑制而不能遷移至檢測器端被檢出［15-16］；④草酸、甲酸的電泳峰位于磷酸根離子電泳峰之前，且與目標峰完全分離，不干擾測定。稍大于乙酸電離常數(shù)值的有機酸因出峰時間較長（10 min以上）而落在檢測窗口之外。另外，土壤浸出液基體顏色不影響測定結果。在實際樣品分析中，為了解決土壤樣品溶液基質引起的校正曲線基體匹配問題，可采用標準加入法，或其他定量方法［16］。本文采用標準加入法。

圖3 土壤樣品（a）及加標土壤樣品（b）的FASI-CE-C4D 電泳譜圖Fig.3 FASI-CE-C4D electropherograms for detection of available phosphorus in the soil sample（a）and spiked soil sample（b）

2.5 方法學評價

在優(yōu)化實驗條件下，對不同濃度的磷酸根離子標準液進行FASI-CE-C4D 測定。結果表明：磷酸根離子質量濃度在16～800 μg/L 范圍內，其峰面積（y）與質量濃度（x，μg/L）間呈良好的線性關系：y= 8.36x-2.12，線性相關系數(shù)為0.998 1。以目標物峰高與背景噪聲的3 倍信噪比（S/N）計算得到磷酸根離子的檢出限為5 μg/L。表明本方法的檢出限可滿足痕量磷酸根離子的檢測要求。

對0.10 mg/L 磷酸根離子溶液平行測定5 次，測得其日內和日間相對標準偏差（RSD）分別為4.0%和4.7%。表明該方法具有較好的重現(xiàn)性，可以滿足土壤中速效磷的定量分析要求。

2.6 實際樣品測定

將建立的方法應用于5 個土壤樣品（采集于中山大學南校區(qū)的不同區(qū)域）及1 個土壤標準樣（GBW07461，速效磷的標注值為11.2±1.6 mg/kg）中速效磷含量的測定。按“1.2”樣品制備方法獲得土壤浸出溶液。由于土壤含有一定量的有機質，浸提液呈淺深不一的黃褐色。采用FASI-CE-C4D 對其速效磷含量進行檢測，經定量分析和單位換算后，結果見表1。土壤樣品中均檢出不同含量的速效磷，范圍為4.91～19.9 mg/kg。其中Sample#5是土壤標準樣，實驗測得值與其標注值基本一致。對實際樣品進行加標回收實驗，每個加標水平進行日內6 次平行試驗，測得加標回收率為92.5%～107%，相對標準偏差（RSD）均小于5.0%。圖3為土壤及加標土壤樣品的FASI-CE-C4D譜圖。

表1 6個土壤樣品中速效磷的含量及加標回收率（n=6）*Table 1 Contents and spiked recoveries of available phosphorus in six soil samples（n=6）*

3 結 論

本研究采用非接觸式電導檢測和FASI在線富集技術，結合毛細管電泳對土壤中的速效磷進行了分離檢測。土壤樣品經水浸取后，無需復雜前處理即可上機檢測。方法操作簡單、靈敏快速，是一種經濟實用、分析成本低的優(yōu)良分析方法，可為土壤中速效磷的快速靈敏檢測提供新途徑。