固相萃取/液相色譜-串聯質譜法測定水果蔬菜中雙胍辛胺的殘留量

秦 富，汪文龍，司露露，蔡翔宇，梁 宇，蘇 華，韋 濤

（南寧海關技術中心，廣西 南寧 530201）

雙胍辛胺是由日本Dainippon Ink and Chemical 公司于1986 年開發的一種具有觸殺與預防性作用的廣譜殺菌劑，雙胍三辛烷基苯磺酸鹽和雙胍辛胺醋酸鹽是雙胍辛胺最常見的2種鹽類殺菌劑，其有效成分和水解產物均為雙胍辛胺。雙胍辛胺及其鹽劑對大多數由子囊菌和半知菌引起的真菌病害有良好的效果［1］，廣泛應用于柑橘、蘋果、番茄、生菜等水果蔬菜的病害防治和防腐保鮮［2-3］。盡管雙胍辛胺屬于低毒性農藥，但對家蠶等生物有較高毒性［4］，若大量使用而釋放至環境中可能對環境和人體產生不良影響［5］。因此，各國均制定了雙胍辛胺的殘留限量標準，其中歐盟規定雙胍辛胺在水果蔬菜等植物源性食品中的殘留量均不能超過0.05 mg/kg［6］，日本規定水中的雙胍辛胺醋酸鹽不能超過6 μg/L［7］。中國規定雙胍三辛烷基苯磺酸鹽（以雙胍辛胺表示）在各種水果和蔬菜中的最大殘留限量為0.2～3 mg/kg［8］，但缺少相關的檢測標準，導致難以對植物源性食品中雙胍辛胺實施有效的監督管理和風險評價，也不利于水果蔬菜的進出口貿易。因此，研究快速、準確測定水果蔬菜中雙胍辛胺殘留量的檢測方法顯得尤為重要。

目前，國內外對雙胍辛胺檢測方法的研究報道較少，其中針對植物源性食品常采用液相色譜法，但需要添加離子對試劑［9］或進行柱后衍生［10］，操作繁瑣，衍生效率難以控制，且靈敏度較低，難以滿足現行相關限量標準的要求。任海濤［11］和李云飛等［12］分別開發了液相色譜-串聯質譜法和高分辨質譜法，但2種方法采集的母離子均為靈敏度和穩定性較差的單電荷加合離子［M+H］+，導致方法的靈敏度低和重現性較差，難以滿足植物源性食品中雙胍辛胺的痕量檢測和定量要求。為此，本研究以沃柑、菠蘿蜜、蘋果、葡萄、生菜、黃瓜、西紅柿、蘆筍為樣本，成功建立了靈敏度、準確度和精密度更好的固相萃取/液相色譜-串聯質譜法，為水果蔬菜中雙胍辛胺殘留的監督檢測以及相關標準制定提供了技術參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

1290 Infinity Ⅱ液相色譜儀、Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）（美國Agilent 公司）； Qtrap 4500 質譜儀（美國AB SCIEX 公司）；BEH Hilic 色譜柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm）、OASIS WCX 固相萃取柱（3 mL/60 mg）（美國Waters 公司）； XS204 電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；飛鴿DL-5-B 離心機（上海安亭科學儀器廠）；KL512J 氮氣濃縮裝置（北京康林科技有限公司）；VOTEX GENIE2 渦旋混合器（美國Scientific Industries 公司）；GM 200 刀式混合研磨儀（德國Retsch 公司）；1.5 mL 聚丙烯短頸螺口瓶（PP 進樣瓶，美國Thermo 公司）；0.22 μm 疏水性聚四氟乙烯（PTFE）針式濾器、0.22 μm 親水PTFE 針式濾器（上海安譜實驗科技公司）；0.2 μm 再生纖維針式濾器（美國Agilent公司）；100 mL聚丙烯容量瓶、250 mL聚丙烯試劑瓶（德國Vitlab公司）。

雙胍辛胺醋酸鹽標準品（CAS：57520-17-9，純度≥90.1%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司），使用甲醇溶解配制標準溶液，濃度以雙胍辛胺計，使用聚丙烯材質的容量瓶和試劑瓶定容和儲存。乙腈、甲醇、二氯甲烷、甲酸為色譜純，購自美國Tedia公司。

1.2 樣品前處理

提取：將水果、蔬菜樣品切碎后，用刀式混合研磨儀制成細碎均勻的試樣。稱取5.00 g 試樣置于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL 0.2%乙酸水和10 mL二氯甲烷，振蕩提取30 min，于4 000 r/min離心5 min。

凈化：分別用3 mL 甲醇和3 mL 水活化平衡WCX 固相萃取柱，取3 mL 上清液以1 滴/s 通過小柱；依次加入2 mL 水和2 mL 甲醇淋洗小柱；再用3 mL 10%甲酸乙腈洗脫并收集至15 mL聚丙烯離心管中；于45 ℃水浴氮吹至近干，加入0.2%甲酸水并定容至1 mL，渦旋混勻，過0.22 μm 疏水性PTFE 針式濾器裝入PP進樣瓶，供儀器分析。

1.3 分析條件

1.3.1 液相色譜條件色譜柱：Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；流動相：A 為0.2%甲酸水，B 為甲醇；以0.35 mL/min 進行梯度洗脫。洗脫程序：0～2.0 min，保持95% A；2.0～3.0 min，95%～15% A；3.0～5.8 min，15%～5% A；5.8～6.0 min，5%～95% A；6.0～8.0 min，保持95%A。

1.3.2 質譜條件離子源：電噴霧離子源，正離子模式（ESI+）；掃描方式：多反應監測（MRM）；氣簾氣（CUR）：1.4×105Pa；碰撞氣（CAD）：Medium；離子源電壓（IS）：4 500 V；離子源溫度（TEM）：500 ℃；霧化氣（GS1）：3.8×105Pa；輔助加熱氣（GS2）：3.8×105Pa；雙胍辛胺的離子對參數：母離子為m/z178.8，定量和定性子離子分別為m/z100.0和187.0，碰撞能（CE）分別為19、19.5 V，去簇電壓（DP）均為80 V。

1.4 定量方法

采用空白基質加標曲線定量。選擇與試樣一致的空白基質，添加系列雙胍辛胺標準溶液，與樣品一同處理后進樣，采用MultiQuant 3.0.2軟件繪制標準曲線并進行定量分析。

2 結果與討論

2.1 質譜條件優化

分別采集雙胍辛胺的［M+H］+和［M+2H］2+加合離子進行質譜參數優化，結果顯示雙胍辛胺的最佳母離子為帶雙電荷的m/z178.8，而單電荷母離子m/z356.6 的響應較差且極其不穩定。可能是由于雙胍辛胺的化學結構兩端均含有C===== N 雙鍵，在離子化過程中易獲得2 個H+形成雙電荷離子加合模式［M+2H］2+。母離子碎裂后形成的響應豐度較好的子離子為m/z69.0、100.0、157.7、187.0（如圖1），經實際樣品檢測驗證，最終選擇響應較好、干擾峰較少的m/z100.0 和187.0 為子離子，該離子參數與文獻［13］基本一致。

圖1 雙胍辛胺的質譜圖Fig.1 Mass spectrum of iminoctadine

2.2 色譜條件優化

雙胍辛胺的極性較強，實驗首選BEH Hilic 色譜柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm）進行分離，結果雙胍辛胺的色譜峰有較嚴重的拖尾，且難以通過調整洗脫程序得到改善。改用C18色譜柱（2.1 mm ×100 mm，1.8 μm）進行分離，結果顯示雙胍辛胺的色譜峰也存在拖尾，但通過優化流動相洗脫程序后可以獲得尖銳、對稱的色譜峰形，所以選用C18色譜柱。進一步考察了0.2%甲酸水-甲醇和0.2% 甲酸水-乙腈作為流動相時雙胍辛胺標準溶液的出峰效果，發現前者的峰形、峰寬和豐度均優于后者。可能是由于雙胍辛胺在甲醇中的溶解性較乙腈好，甲醇的洗脫效果和離子化效果更優，所以選擇0.2%甲酸水-甲醇為流動相。在最佳色譜條件下獲得雙胍辛胺的MRM 色譜峰如圖2所示。使用雙胍三辛烷基苯磺酸鹽和雙胍辛胺醋酸鹽作為標準溶液進行實驗，在相同條件下獲得的色譜峰及響應值一致。

圖2 雙胍辛胺的MRM色譜圖Fig.2 The MRM chromatograms of iminoctadine

由于雙胍辛胺容易吸附在質譜系統的管路、噴針、離子源等部件上造成污染，引起保留時間變動、不規則拖尾等色譜現象，從而影響色譜條件的優化。通過多次連續進樣或對管路、噴針、錐孔等進行沖洗后可以消除該影響。

2.3 前處理方法的優化

2.3.1 提取、凈化條件的優化由于雙胍辛胺的極性較強、易溶于水，使用甲醇、乙腈等有機試劑為提取溶劑時效果較差，因此選擇使用水相進行提取，并加入二氯甲烷萃取弱極性物質從而獲得較好的凈化和分層效果。雙胍辛胺呈堿性，容易與羧基結合，因此選擇經羧基修飾的混合型弱陽離子交換柱WCX進行萃取凈化，可獲得較好的回收率。

采用標準溶液過柱法對凈化條件進行優化。首先，分別使用0.01%氨水、純水和0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%乙酸水配制標準溶液，過WCX 柱，接收流出液上機測定。結果表明，0.01%氨水和純水組檢出低信號，而各乙酸水組均未檢出，表明酸性條件有利于雙胍辛胺在WCX柱上的保留，且水溶液的酸性強弱（pH 3.0～6.5）對其保留效果影響不大。因此，實驗選擇0.2%乙酸水作為提取溶劑。然后，分別使用0.1%氨水乙腈、乙腈和1%、2%、5%、10%、15%甲酸乙腈洗脫上述WCX 柱，收集洗脫液并氮吹復溶后上機測定。結果顯示，使用0.1%氨水乙腈和乙腈作為洗脫液時雙胍辛胺的回收率為0；使用含甲酸的乙腈為洗脫液時，雙胍辛胺的回收率隨著甲酸含量的增加而增加，甲酸含量增至10%后雙胍辛胺的回收率基本達到最優。因此選擇10%甲酸乙腈溶液作為洗脫液。

2.3.2 實驗器具的選擇由于雙胍辛胺易被玻璃吸附，使用玻璃材料的器具或進樣瓶時會導致方法的穩定性和重現性較差。文獻方法［10-11］通過在前處理過程中添加三乙胺溶液減少玻璃器具對雙胍辛胺的吸附。而本方法未使用玻璃器具，容量瓶、試劑瓶、離心管、進樣瓶等均為聚丙烯（PP）材料，因此可有效避免玻璃材料對雙胍辛胺的吸附。

比較了不同過濾器對雙胍辛胺的影響，發現親水PTFE針式濾器和再生纖維素濾器均會明顯吸附雙胍辛胺，而疏水性PTFE針式濾器有較少吸附，但對定量結果無影響。

2.3.3 定容溶液的選擇比較了0.01%氨水、純水和0.1%、0.2%、0.4%、0.8%甲酸水為定容溶液時雙胍辛胺的響應豐度，結果顯示各甲酸水組的響應值無明顯差異，均明顯高于0.01%氨水和純水組。這是因為酸性條件既可促使雙胍三辛烷基苯磺酸鹽水解為雙胍辛胺，促進其在電噴霧離子源的離子化，還可減少管路、噴針等儀器材料的吸附和干擾［7］。因此本研究選擇0.2%甲酸水作為定容溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 基質效應和定量方法選擇具有代表性的沃柑、菠蘿蜜、蘋果、葡萄、生菜、黃瓜、西紅柿、蘆筍8種樣品基質進行方法驗證，發現采用溶劑標準曲線進行定量時，雙胍辛胺的加標回收率均較低，未能滿足定量要求。引起方法回收率偏低主要有兩方面的原因：一是樣品前處理過程造成損失，二是產生了較強的基質抑制效應。參照文獻方法［14］對8 種水果蔬菜樣品進行基質效應（ME）評價。結果顯示，上述水果蔬菜的基質效應分別為5.6%、12.0%、11.2%、10.7%、-9.1%、4.5%、-5.6%、-31.2%，其中生菜、西紅柿和蘆筍為基質抑制效應，其它5 種樣品為基質增強效應。可見，引起雙胍辛胺回收率偏低的原因除了與基質抑制效應有關，還與前處理過程有關。在前處理過程中，雙胍辛胺由于受植物成分和實驗器具的吸附干擾導致其絕對回收率偏低［7，10-11］。目前主要通過添加鹽酸胍降低干擾。而本實驗發現添加鹽酸胍反而降低了雙胍辛胺的回收率。原因在于，上述文獻方法均選擇700 mg［10］或1 000 mg［11］大容量的固相萃取柱，而本研究選擇60 mg 的小容量柱。在柱容量較小的情況下，由于鹽酸胍與雙胍辛胺在與WCX柱進行離子交換過程中發生競爭關系，從而導致雙胍辛胺的保留和回收率降低。因此本研究不添加鹽酸胍，選擇采用空白基質加標曲線定量法來校正雙胍辛胺的回收率。

2.4.2 檢出限與定量下限雙胍辛胺采用雙電荷離子化模式在液相色譜-串聯質譜儀上干擾較小，基線噪音很低，靈敏度很高，其儀器檢出限（S/N≥3）可低至0.000 5 mg/L。但在實際檢測中，由于雙胍辛胺易被植物成分、實驗耗材和進樣系統等吸附干擾，低濃度時回收率較低。另外，當進樣濃度過高時，后續進溶劑空白會出現高于3 倍信噪比的目標信號，因而雙胍辛胺的方法檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）不僅要符合S/N≥3 和S/N≥10 的要求，且其響應值要遠高于該殘余信號值。通過在儀器檢出限的基礎上逐漸增加樣品的加標濃度進行分析，同時對不同濃度雙胍辛胺進樣后造成的系統殘余信號值進行評估，最終確定雙胍辛胺的方法檢出限和定量下限分別為0.005 mg/kg 和0.010 mg/kg。對沃柑、菠蘿蜜、蘋果、葡萄、生菜、黃瓜、西紅柿、蘆筍陰性樣品進行LOD和LOQ水平的加標實驗，結果均滿足以上兩個要求。同時，該方法的LOQ遠低于國家標準規定的最大殘留限量（0.2～3.0 mg/kg）［8］，也低于歐盟的最大殘留限量（0.05 mg/kg）［6］，滿足結果判定要求。

2.4.3 線性關系、回收率與相對標準偏差分別以沃柑、菠蘿蜜、蘋果、葡萄、生菜、黃瓜、西紅柿、蘆筍為樣品基質，添加0、0.005、0.010、0.020、0.040、0.080、0.160 mg/kg 雙胍辛胺進行實驗，以加標濃度為橫坐標（x，mg/kg），峰面積為縱坐標（y）擬合線性方程。按照LOQ、2LOQ 和歐盟限量值3 個濃度水平（0.010、0.020、0.050 mg/kg）添加雙胍辛胺，進行低濃度加標實驗，每個濃度設置6 個平行，考察回收率和相對標準偏差（RSD）。結果如表1所示，各樣品基質在0.005～0.160 mg/kg范圍內的線性關系良好，相關系數r≥0.995；平均加標回收率為88.5%～109%，RSD（n=6）為2.1%～8.8%。

表1 低濃度加標實驗的線性、回收率和相對標準偏差Table 1 Linearity，recoveries and relative standard deviations of standard addition test at low concentrations

為使方法的適用性更強，本研究增加了國家限量標準中雙胍辛胺的常見限量值1 mg/kg 和3 mg/kg的加標實驗。首先嘗試按照0.5、1、2、4、8 mg/kg進行加標曲線分析，結果由于加標濃度過高，導致加標曲線線性較差，不能滿足定量要求。因此當樣品中雙胍辛胺的濃度過高時，需將過柱體積降低至WCX 柱的凈化容量以下。將過柱體積降至0.3 mL，然后對8 種水果蔬菜進行了1 mg/kg 和3 mg/kg 的加標實驗。結果如表2所示，各樣品基質在0.5～8.0 mg/kg 范圍內的線性關系良好，相關系數r≥0.996；1 mg/kg和3 mg/kg水平的平均加標回收率為88.1%～109%，RSD（n=6）為2.8%～10%。

表2 高濃度加標實驗的線性、回收率和相對標準偏差Table 2 Linearity，recoveries and relative standard deviations of standard addition test at high concentration

以上結果表明，本方法在各樣品基質中不同濃度水平的加標回收率和RSD 均滿足“歐盟食品和飼料中農藥殘留及分析的質量控制和方法驗證程序指南”［15］的相關要求，適用于水果蔬菜中不同濃度雙胍辛胺殘留量的篩查和定量分析。

2.5 方法應用

采用本方法對161 批市售水果蔬菜樣品中的雙胍辛胺進行檢測，其中沃柑31 批，菠蘿蜜6 批，蘋果29批，葡萄24批，生菜16批，黃瓜21批，西紅柿24批，蘆筍10批。結果有7批沃柑樣品檢出雙胍辛胺，其余樣品均未檢出。沃柑的檢出率為22.6%，檢出量為0.011～0.066 mg/kg，均遠低于國家最大殘留限量（3 mg/kg）［8］，若按照歐盟的限量標準（0.05 mg/kg）［6］，則有1批次不合格。

3 結 論

本研究以沃柑、菠蘿蜜、蘋果、葡萄、生菜、黃瓜、西紅柿、蘆筍為試樣，建立了固相萃取/液相色譜-串聯質譜檢測水果蔬菜中雙胍辛胺的方法。與現有檢測方法［8-12］相比，該方法選擇聚丙烯材料的容量瓶、離心管、進樣瓶等器具，有效避免了雙胍辛胺受玻璃器具吸附的影響，同時選擇小容量的WCX固相萃取柱使操作更簡單、試劑用量更少，且靈敏度和重現性均較好，適用于各種蔬菜水果中雙胍辛胺殘留量的檢測。