GC-NCI-MS衍生化法同時測定全血中的亞硝酸根和硝酸根

崔婉瑩，趙 鵬，饒渝蘭，于忠山，張云峰*，董林沛，魏春明，吳小軍

（1.中國人民公安大學 偵查學院，北京 100038；2.公安部物證鑒定中心，北京 100038；3.復旦大學基礎醫學院，上海 200032）

亞硝酸鹽廣泛存在于人們日常生活中，在工業中是常用的化工原料，在食品加工中常被用作防腐劑和發色劑。其外觀與食鹽相似，常因誤食、自殺、投毒等原因引起亞硝酸鹽中毒［1-4］。人體短時間攝入大量亞硝酸鹽，會造成高鐵血紅蛋白血癥，引起紫紺癥、頭痛、頭暈、心律加快、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等癥狀，嚴重者導致缺氧性死亡。食入亞硝酸鹽的中毒量為0.3～0.5 g，致死量為3～5 g［5］。

亞硝酸鹽中毒案件中，通常采用離子色譜-質譜法和食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的相關測定標準方法對胃內容物、嘔吐物、剩飯剩菜等體外檢材中的NO-2進行分析［4，6］。由于缺乏成熟的方法，通過對體內檢材的分析檢測來定性案件的案例鮮有報道，缺少體內檢材的檢測結果嚴重制約了中毒的鑒定和案件的偵破。NO-2和NO-3濃度的測定方法較多，包括比色法［7-8］、高效液相色譜法［9-10］、離子色譜法［11-12］、毛細管電泳法［13］和氣相色譜-質譜法（GC-MS）［14-17］等，主要用于人體代謝監測、食品工業和環境監測等方面。通過保留時間和質譜圖進行定性、定量的GC-MS 衍生化法因具有較高的準確性，被廣泛用于血漿、血清、尿液、唾液等生物樣品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的同時定量研究［18-19］，但很難測定全血中的NO-2和NO-3。血液是毒物分析的主要檢材，具有易獲取、不易被污染等優點，血液中的毒物濃度水平可用于解釋中毒或死亡原因。在法醫鑒定領域，由于普遍存在死后溶血現象，往往只能取到全血作為檢材，而取不到血漿或血清。因此本文旨在建立一種靈敏度高、準確性好，可同時定量全血中NO-2和NO-3的GC-MS衍生化分析方法，解決以往亞硝酸鹽中毒案件中全血作為檢材檢測困難的問題。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

分析天平（梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司）；Milli-Q Direct 水純化系統（德國Merck Millipore 公司）；EYELA CM-1000 振蕩器（日本東京理化公司）；HeraeusTM FrescoTM 21 微量離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；IKA MS 3 digital 數顯型圓周振蕩器（德國IKA 公司）；全自動毒品毒物前處理W880 濃縮儀（北京吉艾姆科技有限公司）；QP2010 氣相色譜-質譜（日本Shimadzu 公司）；2 mL離心管（賽譜銳思（北京）科技有限公司）。

亞 硝 酸 鈉（NaNO2，99.999%）、亞 硝 酸 鈉-15N（Na15NO2，≥98.5%）、硝 酸 鈉-15N（Na15NO3，≥98.5%）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT，＞99.0%）、三苯基膦（TPP，＞99.0%）、五氟芐基溴（PFB-Br，99%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硝酸鈉（≥99.0%）購自國藥集團化學試劑有限公司；四辛基溴化銨（TOA-Br，98%）購自德國默克公司；乙醇、乙腈、丙酮、正己烷、甲醇、甲苯、乙酸乙酯、正己烷均為色譜純，購自美國Fisher Scientific 公司；實驗用水為電導率18.2 MΩ·cm-1的去離子水；空白血樣購自北京復興醫院。

1.2 標準溶液與內標溶液的制備

精密稱取NaNO2、NaNO3、Na15NO2和Na15NO3固體標樣，用水分別配制NO-2質量濃度為1 mg/mL、NO-3為12 mg/mL、15NO-2為100 μg/mL、15NO-3為100 μg/mL的儲備液，使用時按需用水逐級稀釋。

1.3 樣品前處理

取抗氧化劑混合溶液（1.5 mg/mL BHT、7.5 mg/mL TPP的乙醇溶液）200 μL于2 mL離心管，減壓濃縮至干，以200 μL 全血樣品復溶混勻。加入40 μg/mL 的15NO-2內標溶液、100 μg/mL 的15NO-3內標溶液各10 μL（即加入后全血中內標的質量濃度分別2、5 μg/mL），隨后立即加入600 μL 乙腈渦旋振蕩5 min。加入200 μL 相轉移試劑（8 mmol/L 的TOA-Br 丙酮溶液），離心10 min，取上清液于2 mL 離心管中。加入100 μL 衍生化試劑（5%的PFB-Br 丙酮溶液）渦旋20 s，70 ℃減壓濃縮40 min。取出加入150 μL異辛烷，振蕩5 min，離心5 min，取上清液至GC-MS進樣瓶待分析。

1.4 色譜與質譜條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：J&W DB-5 MS 石英毛細管氣相色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：氦氣（純度99.999%）；壓力：58.8 kPa；柱流速：1.00 mL/min；進樣口溫度：200 ℃；進樣方式：分流進樣，分流比1∶10，進樣量1 μL；溶劑延遲時間：2.5 min。升溫程序：初始溫度60 ℃，保持5 min；以15 ℃/min升至200 ℃，保持1 min；再以30 ℃/min升至280 ℃，保持1 min。

1.4.2 質譜條件離子源溫度：220 ℃；接口溫度：220 ℃；離子化方式：負化學電離源（NCI）；掃描方式：選擇離子掃描（SIM）。目標物和內標衍生物的色譜保留時間及質譜特征離子見表1。

表1 全血中目標物和內標衍生物的色譜保留時間及質譜特征離子Table 1 Chromatographic retention times and mass spectral characteristic ions of target and internal standard derivatives in whole blood

2 結果與討論

2.1 前處理條件的優化

由于NO-2不穩定、易氧化，通過添加抗氧化劑以減少NO-2在前處理過程中的氧化。結果表明，未添加抗氧化劑和添加抗氧化劑時的氧化比例分別為39.6%和2.4%，添加抗氧化劑可起到減弱氧化的作用。實驗分別對目標物提取溶劑、衍生物提取溶劑、相轉移試劑用量、衍生化方式、衍生化反應時間和溫度進行了優化，優化條件時不添加內標物，通過比較NO-2和NO-3衍生物的平均峰面積選擇最優條件。

2.1.1 目標物提取溶劑和衍生物提取溶劑的選擇考察了分別以乙腈、丙酮、甲醇作為目標物提取溶劑時的效果，結果表明乙腈沉淀蛋白更完全，丙酮次之，甲醇的提取效果最差，因此選擇乙腈作為目標物提取溶劑。對比了采用異辛烷、甲苯、乙酸乙酯、正己烷作為衍生物提取溶劑時的效果，結果表明異辛烷對于衍生化產物PFB-NO2的提取效果最好，甲苯對于衍生化產物PFB-NO3的提取效果最好，其它3種有機溶劑對PFB-NO3的提取效果相差不大。由于甲苯有毒，因此選擇異辛烷作為衍生物提取溶劑。

2.1.2 相轉移試劑用量的選擇相轉移試劑的使用可以增加反應產率和反應物的穩定性，考察了相轉移試劑用量（50、100、150、200、250 μL）對衍生化反應的影響。結果顯示，不同相轉移試劑用量對PFB-NO3的生成無顯著影響，PFB-NO2的生成量則隨相轉移試劑用量的增加而增加，并在200 μL 時達到最大，因此選擇相轉移試劑用量為200 μL。

2.1.3 衍生化方式的選擇考察了水浴衍生后氮吹濃縮、水浴衍生后減壓濃縮和直接減壓濃縮3種衍生化方式對衍生效率的影響（見圖1）。結果表明，氮吹濃縮后再復溶進樣的衍生化效率較低且重現性較差（圖1中未畫出）。水浴衍生后減壓濃縮方式雖小幅提升了NO-2的衍生化效率，但PFB-NO3的峰面積遠小于直接減壓濃縮衍生方式，且直接減壓濃縮可以簡化操作過程。因此選擇直接減壓濃縮的方式，將衍生化與濃縮過程一步進行。

圖1 不同衍生方式生成的PFB-NO2和PFB-NO3峰面積圖Fig.1 Peak areas of PFB-NO2 and PFB-NO3 generated by different derivatization methods

2.1.4 衍生化溫度與時間的選擇分別對比了不同衍生化反應溫度（40、50、60、70、80 ℃）條件下的衍生效率（見圖2）。結果表明當溫度低于70 ℃時，2個反應產物的峰面積隨溫度升高而增大，當超過70 ℃時峰面積下降，因此選擇衍生化溫度為70 ℃。在衍生化溫度為70 ℃條件下，考察了衍生化反應時間（20、30、40、50、60 min）對衍生效率的影響（見圖3）。結果顯示2 種反應產物的峰面積隨反應時間的增加而增大，在40 min 時峰面積達到最大，而后均呈下降趨勢。為使反應物反應完全且不造成衍生產物損失，選擇衍生化時間為40 min。

圖2 衍生化溫度的影響Fig.2 Effect of derivatization temperature

圖3 衍生化時間的影響Fig.3 Effect of derivatization time

2.2 方法選擇性

NO-2、15NO-2、NO-3和15NO-3的標準品溶液衍生后在全掃描模式下的質譜圖如圖4所示，全血中目標物與添加內標衍生后的SIM色譜圖如圖5所示。由圖可知，衍生物PFB-NO2、PFB-15NO2的保留時間為9.370 min，PFB-NO3、PFB-15NO3的保留時間為9.420 min，通過離子碎片m/z46、47、62、63 結合保留時間和碎片離子可對目標物進行定性和定量。

圖4 衍生物PFB-NO2（A）、PFB-15NO2（B）、PFB-NO3（C）、PFB-15NO3（D）在全掃描模式下的質譜圖Fig.4 Mass spectra of derivatives PFB-NO2（A），PFB-15NO2（B），PFB-NO3（C）and PFB-15NO3（D）in full scan mode

圖5 全血中衍生物PFB-NO2、PFB-15NO2（A）和PFB-NO3、PFB-15NO3（B）的SIM色譜圖Fig.5 SIM chromatograms of the derivatives PFB-NO2，PFB-15NO2（A）and PFB-NO3，PFB-15NO3（B）in whole blood

2.3 線性范圍與檢出限

按“1.3”步驟操作，加入不同質量濃度的NO-2和NO-3標準溶液，使全血中NO-2的質量濃度分別為0.05、0.2、0.5、1、2、5 μg/mL，NO-3的質量濃度分別為1、5、10、100、200、300 μg/mL。以加標后的血樣中NO-2/15NO-2（或NO-3/15NO-3）峰面積比值減去空白血中NO-2/15NO（-2或NO-3/15NO-3）峰面積的比值為縱坐標，全血中NO-2和NO-3的質量濃度為橫坐標，以1/X2為權重因子進行線性回歸分析，繪制標準曲線。結果表明，全血中的NO-2和NO-3分別在0.05～5 μg/mL 和1～300 μg/mL范圍內線性關系良好，相關系數（r2）分別為0.995和0.997，檢出限（LOD，S/N= 3）分別為0.01 μg/mL 和0.2 μg/mL，定量下限（LOQ，S/N=10）分別為0.05 μg/mL和1 μg/mL（見表2）。

表2 全血中NO-2 和NO-3 的線性關系、檢出限及定量下限Table 2 Linear relations，detection limits and quantitation limits of NO-2 and NO-3 in whole blood

2.4 提取回收率

提取回收率考察2種目標物質的低、中、高3個質控濃度，每個濃度考察5 個樣品。NO-2質控濃度分別為0.15、1、4 μg/mL，NO-3質控濃度分別為3、30、250 μg/mL。取3 個質控濃度下的空白加標血樣，按照“1.3”步驟操作后進樣得到各待測物的峰面積，記錄NO-2/15NO-（2或NO-3/15NO-3）的比值，減去同批空白血中NO-2/15NO（-2或NO-3/15NO-3）的比值后得到數值A1。同時取對應質量濃度下NO-2、NO-3的基質加標溶液，按“1.3”步驟操作，記錄N-2/15NO（-2或NO-3/15NO-3）的比值，減去同批空白基質中NO-2/15NO（-2或NO-3/15NO-3）比值后得到數值A2，以A1/A2×100%計算提取回收率，結果如表3 所示。結果顯示，全血中低、中、高3個濃度下NO-2的提取回收率分別為118%、109%和99.8%，NO-3的提取回收率分別為88.4%、80.3%和85.1%。

表3 全血中NO-2 和NO-3 的提取回收率、準確度及精密度Table 3 Extraction recoveries，accuracies and precisions of NO-2 and NO-3 in whole blood

2.5 準確度與精密度

選擇定量下限（LOQ）、低、中、高濃度4個點作為質控濃度，每個濃度考察5個樣品：NO-2的質控濃度分別為0.05、0.15、1、4 μg/mL，NO-3的質控濃度分別為1、3、30、250 μg/mL。加入不同質量濃度的NO-2和NO-3質控標液，按“1.3”步驟操作。GC-MS進樣分析后，記錄NO-2/15NO（-2或NO-3/15NO-3）比值，減去同批空白血樣中NO-2/15NO（-2或NO-3/15NO-3）的比值后，代入線性回歸方程反算其實測濃度，分別計算每個質控濃度的準確度、日內和日間精密度（n=3），精密度以相對標準偏差（RSD）表示。由表3可知，4 個質控濃度下NO-2的準確度為89.6%～98.0%，日內RSD 為1.8%～9.2%，日間RSD 為2.1%～6.2%；NO-3的準確度為92.8%～112%，日內RSD為0.60%～14%，日間RSD為0.60%～3.7%。結果表明，所建方法的準確性和重復性良好。

2.6 真實中毒案例應用

2020年9月，某女子被發現在樹林中暈倒，經搶救無效死亡。現場勘查時，發現1袋打開的亞硝酸鈉粉末和半瓶礦泉水。送檢檢材為該女子的血液樣品，取200 μL血液按照本方法進行樣品前處理和分析。測得該女子血液中NO-2和NO-3的質量濃度分別為0.29、224.11 μg/mL。取16份空白血樣，按“1.3”步驟操作，記錄NO-2/15NO-2或NO-3/15NO-3的比值，反算全血中內源性的NO-2和NO-3濃度。得到NO-2的質量濃度為0.05～0.10 μg/mL，NO-3的質量濃度為1.70～7.70 μg/mL。此案件中2種物質的濃度均遠高于人體全血中內源性的濃度水平，可判定為亞硝酸鹽中毒。結果表明，所建方法可滿足實際案件的檢驗需求。

3 結 論

NO-2不穩定、易氧化，進入血液后大部分氧化為NO-3，全血中NO-2和NO-3的同時準確定量是案件定性的關鍵。本文建立了衍生化氣相色譜-負化學電離源-質譜同時測定全血中NO-2和NO-3的方法，通過添加抗氧化劑的方式減少NO-2在前處理過程中的氧化。該方法特異性強、靈敏度高，結果準確、可靠，能夠滿足實際亞硝酸鹽中毒案件的檢驗鑒定需求，可用于實際亞硝酸鹽中毒案例分析。