王傳鋒 米青婕 皮志媛

（新疆伊犁職業技術學院，新疆伊犁 835000）

目前，豬場中以豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroEnteritis virus,TGEV）、豬輪狀病毒（porcine rotavirus,PoRV）以及豬德爾塔冠狀病毒（porcine deltacoronavirus,PDCoV）等病毒性腹瀉性疾病較為常見，主要引起仔豬的腹瀉，成為危害養豬業的主要腹瀉性傳染性疾病，且在豬場中廣泛流行，其感染率和死亡率均較高，嚴重影響養豬業發展[1,2]。而豬感染牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）后會出現類似慢性豬瘟感染癥狀及病理變化，引起許多消滅或控制CSF國家的高度預警，目前許多學者已逐漸關注。PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV等病毒性病原，其臨床特征相似，臨床上以嚴重腹瀉、脫水和損傷仔豬的消化器官為主要特征，各階段的豬均會感染，以仔豬較為嚴重，其致死率可高達80%以上，4種病毒性腹瀉疾病在臨床中常以混合感染為多見，臨床中不易診斷，很難區分，給該病防控帶來一定困難[3,4]。目前病毒性疾病沒有有效藥物可以治療，主要通過疫苗免疫進行預防，其免疫不當，很大可能導致疾病的流行與發生，給養殖戶造成嚴重的經濟損失[5]。因此，應該注意PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV等疾病的疫苗免疫和豬場的凈化，減少該病的發生與流行。

2021年從伊犁河谷地區規模化豬場采集患腹瀉病豬的血液、糞便腸內容物等病料組織1 200份，檢測5種病毒性腹瀉疾病 （PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV）感染與流行情況，為該地區腹瀉病毒性疾病綜合防控提供參考基礎。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2021年從伊犁河谷地區規模化豬場采集患腹瀉病豬的血液、糞便腸內容物等病料組織共1 200份，其中，尼勒克縣182份、新源縣192份、鞏留縣201份、特克斯縣162份、伊寧縣173份、察布查爾縣164份、霍城縣126份。

1.2 主要試劑

質粒提取試劑盒、病毒RNA提取試劑盒、RNA反轉錄試劑盒，均購自TAKARA公司；T載體、瓊脂糖DNA回收試劑盒、DL-2 000 Maker、ExTaq DNA聚合酶均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 病料組織的處理

將采集糞便及腸內容物等病料組織進行處理，加入等量無菌的PBS中均漿，在-80℃反復凍融3～5次，離心后取上清，用0.2 μm濾紙過濾后加入1%雙抗處理0.5 h，-80℃保存備用。

1.4 核酸的提取

血液分離血清后，直接用病毒RNA提取試劑盒提取，糞便及腸內容物等病料組織經過處理后，參照說明書病毒RNA提取試劑盒說明分別提取血清、糞便及腸內容物RNA，用逆轉錄試劑盒反轉為cDNA，-80℃保存備用。

1.5 引物設計與和合成

參考文獻[6]并參照GenBank中登錄的基因序列，設計豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬輪狀病毒（PoRV）、豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）以及牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）等5種病原的特異性鑒定引物（引物序列具體見表1），引物由華大基因有限公司合成。

表1 5種病毒的引物序列

1.6 RT-PCR鑒定與測序

以提取病料組織的核酸為模板，分別加入合成的PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV等5種病毒的引物，用PCR方法分別檢測其PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV陽性率（具體步驟按照RT-PCR說明書執行）。回收陽性樣品的目的基因片段，按照說明書連接到T載體上后，提取質粒送華大基因公司進行測序，其測序結果與GenBank中登錄的參考株進行同源性比對。

2 結果與分析

2.1 病毒RT-PCR檢測結果

以提取的病料組織的核酸為模板，用RT-PCR分別檢測PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV等5種病原。結果顯示，PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV病原菌擴增出目的條帶，分別為231 bp、342 bp、309 bp、1 100 bp、289 bp（見圖1)，選擇陽性樣品連接T載體測序，其PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV的測序結果與GenBank中登錄的參考株比較發現同源性在97.0%～99.0%之間。

圖1 病料組織的RT-PCR檢測結果

2.2 PEDV、 TGEV、 PoRV、 PDCoV、 BVDV檢測結果

利用 RT-PCR進行 PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV目的片段檢測。結果由表2可知，2021年的伊犁河谷地區規模化豬場中PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV總陽性率分別為34.5%、7.4%、22.7%、2.9%、8.2%。其中PEDV和PoRV陽性率較高。

表2 PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV的檢測結果

2.3 PEDV、 TGEV、 PoRV、 PDCoV、 BVDV多重感染檢測結果

對2021年從伊犁河谷地區規模化豬場采集的1 200份樣品，進行PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV陽性率的多重感染率統計分析，由表3可知，PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV等4種病原存在共感染情況，其中以二重感染為主，PEDV/TGEV和PEDV/PoRV二重感染，感染率最高，分別為7.2%、9.4%，說明該地區不同豬場中以二重感染為主。

表3 多重感染檢測結果

3 討論

豬場中病毒性腹瀉是危害養豬業的主要傳染性疾病之一，主要通過疫苗進行免疫，尤其是具有傳染源和疫苗免疫不合理時均可以導致一些病毒性腹瀉疾病的發生與流行，在流行過程中呈現隱性感染或者混合感染，給疾病的診斷和防控帶來一定的困難[11,12]。因此，對豬場中病毒性腹瀉疾病的凈化與綜合防控具有重要意義。本試驗通過對2021年從新疆伊犁河谷地區規模化豬場采集的病豬血液肌及組織樣品，進行 PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV等5種病毒性腹瀉病原的檢測。結果顯示，PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV的總陽性率分別為34.5%、7.4%、22.7%、2.9%、8.2%，且以PEDV和PoRV陽性率較高，以二重感染為主，其中PEDV/TGEV、PEDV/PoRV二重感染率分別為7.2%、9.4%。說明該地區PEDV、PoRV流行率較高，可能與PEDV、PoRV 2種疫苗的免疫效果較差或者不合理有關，導致其陽性率較高。當前，國內養豬企業中，對PEDV、PoRV防控主要通過疫苗免疫來實現，同時疫苗免疫也是預防該病的主要方法，此外，需要注意母豬場中疾病的凈化，防止帶毒傳播。本試驗為該地區豬場中病毒性腹瀉性疾病的防控提供參考依據。