非洲豬瘟病毒主要蛋白研究概述

趙向紅

（山東省菏澤市定陶區畜牧服務中心，山東菏澤 274100）

非洲豬瘟疫情于1921年在肯尼亞被首次報道，1957年傳入西歐及拉美國家后才開始引起世人的關注，2007年以來，疫情在多個國家相繼發生，2017年3月，俄羅斯遠東地區發生的非洲豬瘟疫情與我國僅距1 000 km。2018年沈陽市沈北新區首次發現國內非洲豬瘟病例，此后，疫情在我國31個省份快速點狀發生，至2019年底，我國共報告非洲豬瘟疫情160余起，捕殺、銷毀生豬超過120萬頭，對國內養豬業的健康發展構成了嚴重威脅。科研工作者通過對非洲豬瘟病毒的研究，已經發現一些與病毒致病相關的蛋白，通過對已知蛋白的解析，以期為非洲豬瘟疫情防控提供參考。

1 非洲豬瘟病毒

非洲豬瘟病毒（ASFV）是唯一的雙股蟲媒大核DNA病毒，形態呈對稱的二十面體，直徑約200 nm，堿基數約為17～19萬個，其中包括開放閱讀框151～167個，編碼多種蛋白質，包括結構蛋白和免疫調節蛋白。病毒核內膜為單一脂膜，含p54、p22、p30等蛋白，核衣殼主要為結構蛋白p72，目前僅研究出68種結構蛋白的功能，其中參與復制的蛋白約30個，其余為參與誘導凋亡、破壞凝血、病毒吸附、免疫逃逸等，大多數ASFV基因的功能還是處于未知狀態，使新的疫病防控策略受到嚴重制約。因此，深入研究ASFV的致病基因成為當前研究的熱點。

2 非洲豬瘟病毒研究現狀

2.1 檢測技術

非洲豬瘟疫情給養豬業帶來的損失較大，目前仍沒有疫苗可以防控，只能依靠完善的生物安全防控來阻斷疫情發生。在防控非洲豬瘟疫情方面，主要通過對生豬、豬場內部環境、工作人員等的早期病毒檢測來進行早期清除。為了精確監測非洲豬瘟病毒，對病毒的檢測技術要求也較高，我國于2020年12月14日由國家市場監督管理總局、國家標準化管理委員會共同發布了《非洲豬瘟診斷技術》[1]（GB/T 18648-2020）新版國家標準，代替GB/T 18648-2002，并于2020年12月14日正式實施，新標準規定了非洲豬瘟的臨床診斷和實驗室診斷方法。

非洲豬瘟的實驗室診斷方法，從被檢靶標物質的分子水平上可以分為3大類，即核酸檢測法、病毒檢測法和抗體檢測法。其中，核酸檢測法是指檢測ASFV的一段編碼為p72的蛋白基因序列，包括普通PCR法、熒光定量PCR法和熒光RAA法。病毒檢測法主要利用高敏熒光免疫分析法和夾心ELISA抗原檢測法檢測靶標完整的病毒顆粒。核酸和病毒檢測方法中任何一種檢測陽性，均可診斷為ASF病例；但當檢測結果不一致時，服從熒光定量PCR法和熒光RAA法中的任何一種陽性結果。抗體檢測法中被檢病毒的結構蛋白抗體為p54和p30特異性抗體，包括間接ELISA抗體檢測法、阻斷ELISA抗體檢測法和夾心ELISA抗體檢測法3種酶聯免疫吸附測定法和間接免疫熒光法，任何一項檢測陽性，均可診斷為抗體陽性；但當檢測結果不一致時，所有檢測結果服從間接免疫熒光法。

ASF病原檢測簡單易操作[2]，但耗時較長，還常因一些人為因素影響結果，不適宜做現場檢測。實驗室現行的核酸檢測方法，優點是時間短、靈敏度高，但對操作的環境條件（如溫度、濕度等）要求嚴格。膠體金免疫層析法、酶聯免疫吸附法等血清學檢測技術利用抗原—抗體結合物的檢測，靈敏度高、檢測速度快，易于觀察、特異性強，但有制備抗體時間長、成本高、不穩定的缺點。操作簡便快捷、成本低廉、結果高效準確及多種診斷方法聯合應用將是今后疫病診斷的發展方向。

2.2 病毒研究

由于非洲豬瘟疫情在國內的擴散和蔓延，防控和凈化將是未來一個時期豬場的重點工作，快速、科學的早期診斷技術對控制和預防非洲豬瘟非常重要。目前的研究表明，ASFV較好的抗原表位蛋白產生的抗體滴度高，維持時間長，全球對ASFV研究大多集中在p22、p30、p54、p72、CD2v等結構蛋白方面。

2.2.1 關于p22蛋白

p22是非洲豬瘟病毒感染后早期產生的主要結構蛋白，位于ASFV顆粒的內膜和感染細胞的表面，能被非離子去污劑從病毒表面溶解釋放。有研究表明[3]，非洲豬瘟病毒p22可以與參與不同細胞通路的幾種宿主蛋白相互作用，這些通路有助于病毒感染過程的內吞作用，與非洲豬瘟病毒體外和體內復制過程中的幾個關鍵功能有關。但是，p22基因缺失不會影響ASFV的復制及病毒毒力。還有研究表明p22同時可以誘導豬產生體液免疫及細胞免疫。顏世君等[3]利用某桿狀病毒表達系統表達非洲豬瘟病毒p22蛋白，制備抗p22蛋白單克隆抗體，成功得到可溶性的重組p22蛋白，鑒定結果表明，重組p22蛋白可以特異地與非洲豬瘟病毒陽性血清反應，它的研究將為亞單位疫苗及診斷試劑開發提供一定的幫助。

2.2.2 關于p30蛋白

P30蛋白是最具抗原性的蛋白之一，常在感染后的2～4 h表達，12 h后合成減少，能誘導中和抗體的產生，在整個感染期都能檢測到，是ASFV重要的結構蛋白。我國新修定的ASFV檢測標準中，檢測時的包被抗體是P30蛋白單克隆抗體，酶標抗體是辣根過氧化酶標記的P30蛋白單抗[4]，這種檢測方法操作簡單，可降低假陽性風險，廣泛應用于血清學的檢測。

2.2.3 關于p54蛋白

p54蛋白是病毒入侵豬體后表達的早期膜蛋白，位于病毒的內囊膜，也是研究較多的蛋白之一，免疫原性較好，結構保守，在機體內產生時間早、持續時間長，在病毒的吸附和入侵中具有重要作用。p54蛋白可直接與動力蛋白結合，形成病毒跨膜結構域，實現病毒在胞質內運轉?？梢愿鶕54蛋白特性建立一系列非洲豬瘟病毒的ELISA檢測方法，如曹琛福等[5]基于p54蛋白建立了阻斷ELISA抗體檢測法，也可以制作基于p54蛋白的單克隆抗體的競爭性酶聯免疫吸附試驗（cELISA）。p54蛋白能引發強的IgG免疫應答，能檢測到IgG反應又能檢測到IgM，戴建華等[6]建立了基于p54蛋白的非洲豬瘟抗體膠體金的檢測方法，且該方法快速實用。同時，研究結果表明建立的膠體金試紙條能作為非洲豬瘟抗體的快速檢測方法，可用于大規模流行病學調查和無癥狀感染豬的篩查。

此外，P30蛋白和p54蛋白在非洲豬瘟病毒感染過程中具有相似的作用，常將二者聯合用于研制亞單位疫苗，同時也是DNA疫苗的靶標抗原。如Sanna等[7]利用p30蛋白和p54蛋白研發的非洲豬瘟疫苗的保護率有50%，高于任何用p30蛋白（疫苗保護率0）或p54蛋白（疫苗保護率0）制備的疫苗。

2.2.4 關于p72蛋白

P72蛋白產生在病毒感染后的晚期，其免疫原性好、保守性較強，是病毒主要的核衣殼蛋白，具有高度抗原性和免疫原性，常常用于診斷和疫苗研制[8,9]。如王彩霞等[10]以抗ASFV p72蛋白的特異性單克隆抗體為檢測抗體，建立了特異性檢測ASFV抗體的阻斷ELISA方法。Borca等[11]利用人胚胎腎細胞表達的 ASFV B646L（p72）制備的亞單位疫苗，免疫豬后發現抗原蛋白能夠刺激機體產生體液免疫反應。Lokhandwala等[12]構建了表達p72的重組腺病毒表達載體疫苗，使用該疫苗免疫豬只后，發現疫苗能夠誘導豬機體產生高水平的特異性體液，誘導細胞免疫應答和細胞毒性T淋巴細胞反應。

2.2.5 關于CD2v蛋白

CD2v蛋白作為非洲豬瘟病毒的外膜糖蛋白，由402個氨基酸構成，它的結構類似于T淋巴細胞表面黏附受體CD2，因為豬紅細胞表面有CD2受體，因此，ASFV極易被吸附在紅細胞表面，協助紅細胞結合到感染細胞，與胞外病毒粒子一起促進病毒擴散。CD2v蛋白的C端能幫助病毒定位，促進病毒復制，增加ASFV在宿主體內的傳播，王曼等[13]研究發現CD2v蛋白可以抑制淋巴細胞增殖，參與病毒的復制與傳播和免疫逃逸機制。CD2v蛋白結構和功能的解析促進了它的應用研究，是目前ASFV疫苗研究的熱點，以CD2v為靶點研制的減毒活疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗和病毒載體疫苗均有問世，且具有較大的開發前景。

2.2.6 核酸適配體

近年來，由于核酸適配體成本低、穩定性好，常用作病毒的體外篩選，且在諸多領域均有關注。Spinach是一種類似增強綠色熒光蛋白的核酸適配體，該核酸適配體能夠與熒光染料結合而產生熒光，且細胞通透性強，是目前研究DNA和RNA體外組裝的主要染料指示劑。韓程程等[14]以非洲豬瘟病毒的編碼保守蛋白p54的基因序列片段為檢測目標，結合點亮Spinach RNA適配體的開關功能，運用Spinach—p54的嵌合式RNA適配體，特異地結合目標序列并產生熒光，實現了在RNA水平上對非洲豬瘟病毒的快速檢測。

除上述幾種非洲豬瘟病毒的熱點蛋白外，病毒的A104R、B602L和K205R等基因[15]也都可作為靶抗原，用于疫苗的研制，但由于細胞的免疫保護率數據不足影響了疫苗的研發。深入探索ASFV保護性抗原與現有病毒多樣性之間的關系，有助于亞單位疫苗的研發。

3 結語

非洲豬瘟病毒已經在我國形成了較大范圍的污染，防控和凈化將是一個漫長的過程。撲殺感染豬只和生物安全措施的防控作用較有限，目前亟需安全有效的疫苗控制非洲豬瘟疫情。但是人們對ASFV的免疫機理和免疫逃逸機制的認識和研究還有一定的局限性，阻礙著疫苗的研發進程。此外，非洲豬瘟病毒在長時間流行和傳播過程中存在毒力減弱趨勢[16]，未來臨床中癥狀溫和、乃至無臨床癥狀感染的非洲豬瘟病例可能出現，“耐過豬”難以被及時發現，使防控形勢更加復雜。因此，快速、準確、便捷的診斷技術是控制和預防非洲豬瘟疫情的重要手段，解析ASFV的特點，研制出安全、有效的疫苗是目前防控形勢的迫切要求。