冠心病患者血清miR-144和FOXF1表達及與冠狀動脈病變嚴重程度的關系

劉永俊 陳新榮 李永超 楊春

冠心病是冠脈粥樣硬化導致的冠脈管腔狹窄、阻塞，繼而引起相應部位心肌缺血缺氧和壞死的心臟疾病[1]。微小核糖核酸(miRNA)是具有廣泛生物學調控作用的小分子非編碼RNA，在關鍵信號轉導、脂質穩態、脂蛋白代謝、內皮細胞炎癥和斑塊形成中發揮關鍵調控作用，與心血管疾病發病和進展密切相關[2]。miR-144在心肌細胞中有豐富表達，miR-144轉錄后可調節ATP結合盒轉運蛋白A1(ATP binding cassette transport protein A1，ABCA1)表達和血漿高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平，參與動脈粥樣硬化進程[3]。叉頭盒蛋白F1(fork head box protein F1，FOXF1)是一類與胚胎發育和腫瘤發生密切相關的轉錄因子，具有調節血管發育，調控血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)信號轉導作用，FOXF1表達異常與動脈粥樣硬化的發生密切相關[4]。本研究檢測冠心病患者血清miR-144、FOXF1表達，分析其與冠狀動脈病變的關系，以期為臨床病情監測和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年1月至2020年3月我院收治的108例冠心病患者(冠心病組)，另選擇同期于我院門診體檢的100例年齡、性別相匹配志愿者為對照組，均行心電圖、超聲心動圖、實驗室檢查或CT心血管造影或冠狀動脈造影排除冠心病。本研究獲得醫院倫理委員會批準。所有受試者及其家屬知情同意簽署同意書。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①符合《臨床冠心病診斷與治療指南》[5]；②年齡>18周歲；③均行冠脈造影檢查。

1.2.2 排除標準：①合并甲狀腺癌、結腸癌、大腸癌等惡性腫瘤；②貧血、免疫系統疾病；③合并腦梗死。

1.3 血清miR-144與FOXF1檢測 冠心病組入院第2天(對照組體檢當日)采集肘靜脈血3 ml平均注入干燥試管，干燥試管標本經離心(4℃，3 000 r/min，15 min，半徑10 cm)后取血清-80℃保存待檢。RT-PCR 檢測miR-144和FOXF1表達：TRIzol法提取總RNA，M-mlV 逆轉錄酶(Epicentre 公司)將吸光度值A260/A280 RNA樣品轉錄為cDNA。采用美國Bio-Rad公司生產的CFX96實時熒光PCR 儀檢測血清中miR-144、FOXF1表達，引物序列(由上海基康公司完成)：miR-144上游5’-ACACTCCAGCTGGGTACAGTATAGATGATG-3’。下游5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGTACATC-3’；FOXF1上游5’-CCTCGCACCTGGAGGCTGGCTG-3’，下游5’-TTATCAGTTGGGAAAATAGTA-3’。β-actin(內參)上游：5’-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3’，下游：5’-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3’。反應條件：95℃變性10 s，65℃退火20 s; 75℃延伸15 s，共40個循環。2-ΔΔCt計算miR-144和FOXF1相對表達量，共3次平行試驗，取平均值。

1.4 冠狀動脈造影 按照標準Judkins法[6]進行冠狀動脈造影術，根據冠脈造影結果記錄累及冠脈支數，分為單支病變組(37例)、雙支病變組(48例)、多支病變組(三支及以上，23例)；冠脈狹窄程度，根據冠脈狹窄率(DS)分為[7]Ⅰ度～Ⅱ度組(80例，Ⅰ級狹窄：50.00%≤DS<70.00%，Ⅱ級狹窄：70.00%≤DS<90.00%)、Ⅲ度～Ⅳ度組(28例，Ⅲ級狹窄：90.00%≤DS≤99.00%，Ⅳ級狹窄：DS>99.00%)。SYNTAX積分計算方法主要是通過計算機程序得出，自網站www.syntaxscore.com計算SYNTAX積分。根據SYNTAX 積分評價冠狀動脈病變嚴重程度[8]并進行分組：輕度組，SYNTAX 積分0～22分，共35例；中度組，SYNTAX積分23～32分，共44例；重度組，SYNTAX積分>32分，共29例。

2 結果

2.1 2組血清miR-144和FOXF1表達比較 冠心病組血清miR-144表達高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，FOXF1表達低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組血清miR-144和FOXF1表達比較

2.2 2組基線資料比較 冠心病組體重指數(BMI)、冠心病家族史比例、合并高血壓比例、合并糖尿病比例、合并高血脂癥比例高于對照組(P<0.05)，2組年齡、性別比差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 2組基線資料比較

2.3 不同冠脈病變程度患者血清miR-144和FOXF1表達比較 多支病變組血清miR-144表達高于雙支病變組和單支病變組(P<0.05)，FOXF1表達低于雙支病變組和單支病變組(P<0.05)。雙支病變組血清miR-144表達高于單支病變組(P<0.05)，FOXF1表達低于單支病變組(P<0.05)。重度冠脈病變組血清miR-144表達高于中度冠脈病變組和輕度冠脈病變組(P<0.05)，FOXF1表達低于中度冠脈病變組和輕度冠脈病變組(P<0.05)。中度冠脈病變組血清miR-144表達高于輕度冠脈病變組(P<0.05)，FOXF1表達低于輕度冠脈病變組(P<0.05)。Ⅲ度～Ⅳ度組血清miR-144表達高于Ⅰ度～Ⅱ度組(P<0.05)，FOXF1表達低于Ⅰ度～Ⅱ度組(P<0.05)。見表3。

表3 不同冠脈病變程度患者血清miR-144和FOXF1表達水平

2.4 相關性分析 miR-144表達與冠脈病變支數、冠脈狹窄率、SYNTAX積分呈正相關(P<0.05)，FOXF1表達與冠脈病變支數、冠脈狹窄率、SYNTAX積分呈負相關(P<0.05)。miR-144表達與FOXF1表達呈負相關(r=-0.927，P=0.000)。見表4。

表4 miR-144、FOXF1與冠脈病變支數、冠脈狹窄率、SYNTAX積分相關系數

2.5 miR-144、FOXF1診斷重度病變的價值分析 根據約登指數獲得miR-144、FOXF1診斷重度病變的最佳截斷值分別為4.02、0.85，曲線下面積分別為0.698、0.658，聯合miR-144、FOXF1診斷重度病變的曲線下面積為0.932，高于單獨miR-144、FOXF1(Z=2.412、2.569，P=0.012、0.010)。見圖1，表5。

圖1 miR-144、FOXF1診斷重度病變的ROC圖

表5 miR-144、FOXF1診斷重度病變的效能分析

3 討論

冠心病是全球影響中老年人健康和生命安全的慢性疾病之一，隨著社會老齡化，冠心病住院率不斷增加[9]。動脈粥樣硬化是冠心病發病基礎，脂質代謝異常、炎性反應、內皮功能紊亂等貫穿動脈粥樣硬化形成發展和破裂的整個過程[10]。miRNAs通過與靶mRNA的堿基對結合轉錄后調節基因表達，通過調控內皮細胞、血管平滑肌細胞增殖和凋亡，炎性反應，脂質代謝，血小板功能等參與動脈粥樣硬化和心血管疾病發病過程[11,12]。因此探討與冠心病相關的miRNAs有助于了解病情，為臨床治療提供新的靶點和方向。

miR-144定位于人類染色體17q11.2區域，在淋巴瘤、白血病、胃癌、結直腸癌等多種惡性腫瘤中表達異常，并通過不同靶基因發揮致癌基因或抑癌基因作用，參與腫瘤增殖，凋亡，遷移和轉移過程[13]。miR-144-3p還可靶向環氧合酶2參與子癇前期的發病機制[14]。miR-144在心血管疾病的報道筆者所見并不多見，本研究發現冠心組血清miR-144表達高于對照組，且多支病變組、冠脈狹窄Ⅲ度～Ⅳ度組、重度冠脈病變組血清miR-144表達高于單支/雙支病變組、冠脈狹窄Ⅰ度～Ⅱ度組和輕/中度冠脈病變組，說明miR-144不僅與冠心病發病有關，而且與冠心病患者冠脈病變程度有關。分析miR-144參與冠心病發病和冠脈病變進展的機制：(1)miR-144具有調節膽固醇穩態和炎性反應作用，miR-144過表達可增強炎性因子白介素-1β，白介素-6和腫瘤壞死因子-α的表達，抑制了巨噬細胞衍生的泡沫細胞中膽固醇外流，降低HDL-C水平，進而加速動脈粥樣硬化的病理進展[15]。miR-144調控膽固醇穩態和炎性反應可能通過靶向ABCA1實現[16]。(2)miR-144具有調節心肌細胞增殖和凋亡作用，miR-144通過直接靶向TBX1激活Janus酪氨酸激酶2(JAK2)/信號轉導和轉錄活化因子1(STAT1)途徑，miR-144過表達通過TBX1/JAK2/STAT1途徑促使心肌細胞凋亡[17]。心肌細胞凋亡與心血管疾病的發生密切相關，在心肌缺血缺氧、缺血再灌注損傷、急性心肌梗死時可導致心肌細胞壞死和凋亡[18]，發生不可逆心肌損傷。由此可見miR-144還可調控心肌細胞增殖和凋亡參與冠心病發病和進展。

FOXF1是叉頭盒蛋白轉錄因子家族的成員，在胚胎、食管、氣管、肺等多組織中廣泛表達，參與血管內皮細胞增殖生長和VEGF信號傳導，在維持脈管系統穩定方面發揮重要作用[19]。有研究顯示FOXF1基因突變可抑制血管生成關鍵轉錄調節因子-信號轉導和轉錄活化因子3(STAT3)轉錄，抑制肺泡毛細血管生成[20]。FOXF1還可通過轉錄激活SNAI1誘導上皮間質轉化，促使結直腸癌侵襲和轉移[21]。FOXF1是否參與冠心病發病機制尚不清楚，本研究結果表明冠心病組血清FOXF1表達明顯低于對照組，FOXF1表達于冠脈病變支數、冠脈狹窄率、SYNTAX積分呈負相關，說明FOXF1表達缺失可導致冠脈病變的發生，冠脈病變范圍的擴大和程度的加重。分析原因，FOXF1在內皮集落形成細胞選擇性表達，FOXF1過表達可特異性誘導Notch2受體表達促使內皮祖細胞增殖和新生血管形成[22]，FOXF1表達缺乏則不利于冠脈阻塞后新生血管和側支循環的形成，進一步加重心肌缺血缺氧甚至壞死，導致嚴重的冠脈病變結果。

本研究相關性分析結果表明，miR-144表達與FOXF1呈負相關，提示在冠脈病變過程中miR-144與FOXF1可能存在相互抑制作用機制。Liu等[22]報道指出FOXF1為miR-144的靶基因，miR-144可與FOXF1靶向結合并抑制FOXF1的表達，誘導血管平滑肌細胞凋亡。ROC分析聯合miR-144、FOXF1可用于鑒別重度冠脈病變和輕中度冠脈病變，可為臨床識別高風險人群提供參考。

綜上所述，冠心病患者血清miR-144表達上調，FOXF1表達下調，miR-144過表達、FOXF1表達缺乏均與冠脈病變程度加重，范圍擴大有關。在冠脈病變過程中，miR-144可能通過抑制FOXF1表達導致和加重冠脈病變，兩者在冠脈病變程度評估中有較高應用價值。