蛇床子素調控circ_0084043/miR-338-3p對高糖誘導的心肌細胞損傷的影響

袁雯 楊昕宇 楊華

糖尿病性心肌病屬于糖尿病并發癥之一，是指糖尿病引起的一種心肌病變，可誘發心肌性壞死進而引起心力衰竭、心源性休克等最終造成患者死亡，氧化應激是促使糖尿病并發癥發生的重要原因之一，同時蛋白與脂質過氧化等誘導的心肌細胞凋亡是造成糖尿病性心肌病的重要原因[1]。已有研究報道指出部分中藥具有抗炎、抗氧化等作用，還可促進高糖誘導的心肌細胞生長及抑制炎性因子相關基因的表達[2]。蛇床子素是天然植物蛇床子萃取的單體，其具有抗炎、調節免疫等作用外，還可抑制炎性反應而減輕大鼠心臟缺血再灌注損傷[3]。但蛇床子素與糖尿病性心肌病相關報道相對較少。環狀RNA(circRNA)在糖尿病中表達異常，并可能參與糖尿病并發癥形成過程，已有研究表明circ_0084043在糖尿病性視網膜病變中表達水平升高，并可通過充當miR-140-3p的海綿分子而促進糖尿病性視網膜病變的發展[4]。生物信息學分析顯示circ_0084043與miR-338-3p存在結合位點，研究表明miR-338-3p在高糖誘導的血管內皮細胞中表達水平降低，circVEGFC通過調控miR-338-3p/HIF-1α/VEGFA軸促進高糖誘導的血管內皮細胞凋亡[5]。但circ_0084043/miR-338-3p分子軸是否可介導蛇床子素對糖尿病性心肌病的治療過程尚未可知。因此，本研究采用高糖誘導心肌細胞H9C2建立細胞損傷模型，探討蛇床子素是否可通過調控circ_0084043/miR-338-3p影響高糖誘導的心肌細胞增殖、凋亡及氧化應激。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 蛇床子素購自長沙上禾生物；心肌細胞H9C2購自美國ATCC；DMEM培養基購自美國Gibco；胎牛血清購自上海玉博生物；RNA提取試劑盒、逆轉錄、熒光定量PCR試劑購自美國Thermo Fisher；LipofectamineTM2000、凋亡檢測試劑盒、MTT試劑購自北京索萊寶；MDA、SOD檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；兔抗鼠Bax、Bcl-2抗體購自美國CST；HRP標記的山羊抗兔IgG二抗購自美國Abcam。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組:H9C2細胞培養于含有30 mmol/L葡萄糖的培養基內培養24 h，記為高糖組(HG組)。H9C2細胞培養于含有5.5 mmol/L葡萄糖的培養基內培養24 h，記為正常糖組(NC組)。H9C2細胞分別加入含有不同濃度(10 nmol/L、33 nmol/L、100 nmol/L)的蛇床子素與30 mmol/L葡萄糖的培養基內培養24 h，分別記為HG+蛇床子素低劑量組、HG+蛇床子素中劑量組、HG+蛇床子素高劑量組。si-NC、si-circ_0084043分別轉染入H9C2細胞后加入含有30 mmol/L葡萄糖的培養基內培養24 h，分別記為HG+si-NC組、HG+si-circ_0084043組。pcDNA、pcDNA-circ_0084043分別轉染入H9C2細胞后加入含有100 nmol/L蛇床子素與30 mmol/L葡萄糖的培養基內培養24 h，分別記為HG+蛇床子素高劑量+pcDNA組、HG+蛇床子素高劑量+pcDNA-circ_0084043組。

1.2.2 qRT-PCR檢測細胞中circ_0084043、miR-338-3p的表達水平:根據RNA試劑盒說明書提取各組H9C2細胞總RNA，檢測RNA濃度后置于-80℃冰箱內保存。采用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA，PCR擴增反應體系：SYBR Green Master Mix 10 μl，正反向引物0.8 μl，cDNA 2 μl，ddH2O補足體系至20 μl；反應條件：95℃預變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循環。circ_0084043以GAPDH為內參，miR-338-3p以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算circ_0084043、miR-338-3p相對表達量。

1.2.3 MTT檢測細胞增殖:收集各組H9C2細胞(1×105個/ml)接種于96孔板(150 μl/孔)，分別加入MTT溶液(20 μl/孔)與DMSO(150 μl/孔)，室溫避光孵育5 min后檢測細胞吸光度值(OD值)。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率:收集各組H9C2細胞加入預冷PBS洗滌，棄上清后將500 μl結合緩沖液加入細胞沉淀中，分別加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，振蕩搖晃孵育10 min后檢測細胞凋亡率。

1.2.5 檢測氧化應激指標MDA、SOD的水平:采用反復凍融法裂解各組H9C2細胞，根據試劑盒說明書檢測細胞中MDA、SOD的水平。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測circ_0084043與miR-338-3p的靶向關系:Circular RNA Interactome預測顯示circ_0084043與miR-338-3p存在結合位點，分別構建野生型載體WT-circ_0084043與突變型載體MUT-circ_0084043，miR-NC、miR-338-3p mimics分別與WT-circ_0084043、MUT-circ_0084043共轉染入H9C2細胞后繼續培養24 h，收集細胞并檢測熒光素酶活性。

1.2.7 Western blot檢測Bax、Bcl-2蛋白表達:提取各組H9C2細胞總蛋白后檢測蛋白濃度，取50 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃條件下孵育一抗稀釋液(1∶1 000)過夜，TBST洗滌，室溫條件下孵育二抗稀釋液(1∶2 000)1 h，滴加ECL，應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

2 結果

2.1 蛇床子素對高糖誘導的H9C2損傷的影響 與NC組比較，HG組circ_0084043的表達水平升高(P<0.05)，miR-338-3p的表達水平降低(P<0.05)，細胞活力降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)；與HG組比較，HG+蛇床子素低劑量組、HG+蛇床子素中劑量組、HG+蛇床子素高劑量組circ_0084043的表達水平降低(P<0.05)，miR-338-3p的表達水平升高(P<0.05)，細胞活力升高(P<0.05)，凋亡率降低(P<0.05)，Bax蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，且不同劑量組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 蛇床子素對高糖誘導的H9C2凋亡的影響;A 蛇床子素對高糖誘導的H9C2中Bax、Bcl-2蛋白表達的影響;B 蛇床子素可抑制高糖誘導的H9C2凋亡

表1 不同濃度蛇床子素對高糖誘導的H9C2損傷的影響

2.2 蛇床子素對高糖誘導的H9C2氧化應激的影響 與NC組比較，HG組MDA的水平升高(P<0.05)，SOD的活性降低(P<0.05)；與HG組比較，HG+蛇床子素低劑量組、HG+蛇床子素中劑量組、HG+蛇床子素高劑量組MDA的水平降低(P<0.05)，SOD的活性升高(P<0.05)，且不同劑量組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同濃度蛇床子素對高糖誘導的H9C2氧化應激的影響

2.3 干擾circ_0084043對高糖誘導的H9C2損傷的影響 與HG+si-NC組比較，HG+si-circ_0084043組miR-338-3p的表達升高(P<0.05)，細胞活力升高(P<0.05)，凋亡率降低(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)，Bax蛋白降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白升高(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 干擾circ_0084043對高糖誘導的H9C2凋亡的影響;A 干擾circ_0084043可抑制高糖誘導的H9C2凋亡;B 干擾circ_0084043對高糖誘導的H9C2中Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

表3 干擾circ_0084043對高糖誘導的H9C2損傷的影響

2.4 circ_0084043可逆轉蛇床子素對高糖誘導的H9C2損傷的影響 與HG+蛇床子素高劑量+pcDNA組比較，HG+蛇床子素高劑量+pcDNA-circ_0084043組細胞的活力降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，MDA的水平升高(P<0.05)，SOD的活性降低(P<0.05)，Bax蛋白水平明顯升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 circ_0084043可逆轉蛇床子素對高糖誘導的H9C2凋亡的影響;A circ_0084043可逆轉蛇床子素對高糖誘導的H9C2凋亡的影響;B circ_0084043可逆轉蛇床子素對高糖誘導的H9C2中Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

表4 circ_0084043可逆轉蛇床子素對高糖誘導的H9C2損傷的影響

2.5 circ_0084043靶向miR-338-3p Circular RNA Interactome預測顯示circ_0084043與miR-338-3p存在結合位點。miR-338-3p過表達可降低野生型載體WT-circ_0084043的熒光素酶活性(P<0.05)，而對突變型載體MUT-circ_0084043的熒光素酶活性無明顯影響。見圖4，表5。

圖4 circ_0084043和miR-338-3p的互補序列

表5 雙熒光素酶報告實驗

3 討論

目前糖尿病性心肌病的發病機制尚未闡明，體內持續處于高糖狀態可促進炎癥、氧化應激等反應的發生而促進心肌細胞凋亡，部分中藥的活性成分可減輕高糖誘導的心肌細胞損傷，但其作用途徑、作用靶點相關研究較少[6]。circRNA在糖尿病心肌病中表達異常，并可能作為早期診斷及治療糖尿病心肌病的生物標記物[7]。但circRNA是否可作為中藥治療糖尿病性心肌病的潛在靶點尚未可知。

蛇床子素是從蛇床果實中提取，具有抗炎、抗癌等作用，且研究表明蛇床子素可減輕類風濕性關節炎大鼠的軟骨細胞損傷[8]。蛇床子素可減輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷，并可抑制ROS介導的線粒體凋亡[9]。但蛇床子素對高糖誘導的心肌細胞損傷的影響尚未可知。本研究結果顯示，高糖誘導的心肌細胞活力與Bcl-2蛋白水平降低，凋亡率與Bax蛋白水平升高，與報道結果[10]相似，提示成功建立糖尿病性心肌病心肌細胞損傷模型。本研究分析顯示，蛇床子素處理后高糖誘導的心肌細胞活力升高，凋亡率降低，呈劑量依賴性，提示蛇床子素可促進高糖誘導的心肌細胞增殖而抑制細胞凋亡。本研究結果顯示，高糖誘導的心肌細胞中MDA的水平升高，SOD的活性降低，與報道結果[11]相似，而蛇床子素處理后高糖誘導的心肌細胞中MDA水平降低，SOD的活性升高，且呈劑量依賴性，提示蛇床子素可明顯抑制高糖誘導的心肌細胞氧化應激。

本研究結果顯示，高糖誘導的心肌細胞中circ_0084043的表達升高，而蛇床子素處理后高糖誘導的心肌細胞中circ_0084043的表達降低，且隨著藥物濃度增加而明顯降低，提示蛇床子素可能通過下調circ_0084043的表達發揮作用。研究表明circ_0084043在黑素瘤中表達水平升高，并可能發揮癌基因作用[12]。本研究顯示干擾circ_0084043表達后高糖誘導的心肌細胞活力升高，凋亡率降低，MDA水平降低，SOD活性升高，提示干擾circ_0084043表達可促進高糖誘導的心肌細胞增殖而抑制細胞凋亡及氧化應激。為探究circ_0084043在高糖誘導的心肌細胞損傷中的作用機制，本研究證實circ_0084043可充當miR-338-3p的海綿分子而負向調控miR-338-3p的表達。有研究表明miR-338-3p在妊娠高血壓患者外周血和胎盤中的表達水平升高[13]。miR-338-3p在脂多糖誘導的人支氣管上皮細胞中表達下調，circ_0038467可通過充當miR-338-3p的海綿分子而促進細胞損傷[14]。本研究顯示，高糖誘導的心肌細胞中miR-338-3p的表達水平降低，蛇床子素可明顯促進miR-338-3p的表達，且呈劑量依賴性，而circ_0084043過表達可通過抑制miR-338-3p的表達而明顯逆轉蛇床子素對高糖誘導的心肌細胞增殖、凋亡及氧化應激的作用。

綜上所述，高糖誘導的心肌細胞中circ_0084043的表達水平升高，miR-338-3p的表達水平降低，蛇床子素可抑制circ_0084043的表達而促進miR-338-3p的表達，并可促進高糖誘導的心肌細胞增殖而抑制細胞凋亡及氧化應激，circ_0084043過表達可拮抗蛇床子素對高糖誘導的心肌細胞損傷的作用，本研究證實蛇床子素可通過調控circ_0084043/miR-338-3p分子軸而減輕高糖誘導的心肌細胞損傷。