重組人胰島素注射液中異天冬氨酸含量檢測(cè)*

李 恒，晏菊姣，范曉磊，宋德芳，吳健鴻△，周朝暉

（1. 武漢藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，湖北 武漢 430075； 2. 東北大學(xué)化學(xué)與生物化學(xué)系·巴奈特化學(xué)與生物分析研究所，美國(guó) 波士頓 02115）

脫酰胺化是常見(jiàn)的蛋白翻譯后修飾形式，普遍存在于蛋白、多肽類藥物中。藥物蛋白在生產(chǎn)、存儲(chǔ)過(guò)程中天冬酰胺（Asn）殘基發(fā)生非酶催化脫酰胺反應(yīng)［1］，產(chǎn)生特異性降解產(chǎn)物異天冬氨酸（isoAsp），可改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能［2-3］，并可能導(dǎo)致蛋白活性下降［4-5］。重組人胰島素由51 個(gè)氨基酸組成，含有3 個(gè)天冬酰胺殘基，Asn21位點(diǎn)易發(fā)生脫酰胺反應(yīng)［6］，2020年版《中國(guó)藥典（三部）》中對(duì)A21脫氨人胰島素進(jìn)行了雜質(zhì)控制［7］。目前，胰島素注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的逐步提升使其制劑工藝不斷改進(jìn)，其質(zhì)量顯著提高。蛋白的脫酰胺化研究已列入生物技術(shù)藥物質(zhì)量控制的相關(guān)內(nèi)容［1］。本研究中應(yīng)用IsoQuant?定量試劑盒，建立了測(cè)定重組人胰島素注射液中脫酰胺產(chǎn)物isoAsp 含量的高效液相色譜（HPLC）法。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；XS205BU型電子天平（精度為0.01 mg），Mettler SevenEasy 型pH 計(jì)，均購(gòu)于梅特勒- 托利多儀器公司；Classic型超純水機(jī)（Elga 公司）；Vortex-Kylin-Bell 5 型渦旋儀（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；DK - S26 型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SK250LHC 型超聲波清洗儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為50 kHz）；R1750R 型高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；AP -9928-3型真空泵（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 試藥

重組人胰島素注射液［諾和諾德（中國(guó)）制藥有限公司，商品名諾和靈?，批號(hào)分別為2020010192 和2020061612，規(guī)格為300 IU/ 3 mL（筆芯），質(zhì)量濃度為3.5 mg/ mL］；重組人胰島素標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為140633-201907，含量為27.2 IU/mg）；IsoQuant?定量試劑盒［美國(guó)Promega 公司，貨號(hào)為MA1010，批號(hào)為0000387327，S- 腺苷-L- 高半胱氨酸（SAH）含量為14.97 μmol/ L，IsoAsp - DSIP 含量為96.1 μmol/ L，S- 腺苷-L- 甲硫氨酸（SAM）含量為1 mmol/L，異天冬氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（PIMT），5 倍反應(yīng)緩沖液，0.3 mol/ L 磷酸］；磷酸二氫鉀（批號(hào)為20190509）、磷酸氫二鉀（批號(hào)為20180109）、無(wú)水硫酸鈉（批號(hào)為20181023）、磷酸（批號(hào)為20160425）、乙醇胺（批號(hào)為20200807），均為分析純，鹽酸（優(yōu)級(jí)純，批號(hào)為20190118），均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純，Scharlau公司，批號(hào)為20277613）。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC 法測(cè)定isoAsp 含量

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate?XB - C18柱（100 mm ×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；采用二極管陣列檢測(cè)器（DAD）；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；進(jìn)樣量：40 μL；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相：10%甲醇溶液（含7.9 mmol/L 磷酸二氫鉀和1.1 mmol/L磷酸氫二鉀，用磷酸調(diào)pH至6.2，A）-甲醇（B），梯度洗脫（程序見(jiàn)表1）。

表1 梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution procedure（%）

2.1.2 溶液制備

SAH 對(duì)照品溶液：取IsoQuant?定量試劑盒，于室溫放置30 min 解凍，取試劑盒中SAH 對(duì)照品（濃度為14.97 μmol/L），分別精密吸取0.5，1.0，2.0，3.0，5.0，10.0 μL，置200 μL進(jìn)樣瓶中，加水稀釋至60 μL，制備含量分別為0.125，0.250，0.500，0.750，1.250，2.500 μmol/L的系列SAH對(duì)照品溶液。

isoAsp - DSIP 質(zhì)控對(duì)照溶液：取IsoQuant?定量試劑盒，于室溫放置30 min 解凍，取試劑盒中的IsoAsp -DSIP質(zhì)控對(duì)照品濃度為96.1 μmol/L），精密吸取2 μL，置200 μL 離心管中，加水稀釋至50 μL，得濃度為3.84 μmol/L的isoASP-DSIP質(zhì)控對(duì)照溶液。

酶反應(yīng)溶液：取重組人胰島素注射液（批號(hào)為2020010192），取上述isoAsp - DSIP 質(zhì)控對(duì)照溶液（濃度為3.84 μmol/L）和水（空白）各10 μL，分別置200 μL離心管中，平行2 份，各加入主反應(yīng)混合物（MM）溶液［水-5倍反應(yīng)緩沖液-SAM-PIMT（1∶1∶1∶1，V/V/V/V）］40 μL，輕輕渦旋并離心（轉(zhuǎn)速為12000 r/min），以確保液體均在管底。將離心管放置在30 ℃的水浴中30 min，取出，置冰上，加終止液（0.3 mol/ L 磷酸）10 μL，放置5～10 min 至反應(yīng)完全，輕輕渦旋并離心（4 ℃，轉(zhuǎn)速為12000 r/ min），取上清液，置200 μL 進(jìn)樣瓶中，4 ℃避光保存。

2.1.3 測(cè)定法

取SAH 對(duì)照品溶液（濃度為1.25 μmol/ L），以及參與酶反應(yīng)的供試品溶液、isoAsp - DSIP 質(zhì)控對(duì)照溶液、水（空白）各40 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中SAH 的含量，酶反應(yīng)溶液中測(cè)得1 mol SAH 相當(dāng)于樣品中蛋白含有1 mol isoAsp，以此計(jì)算重組人胰島素注射液和IsoAsp-DSIP 質(zhì)控對(duì)照溶液中蛋白的isoAsp含量。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.1.4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別取2.1.2項(xiàng)下系列SAH對(duì)照品溶液各40 μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以SAH進(jìn)樣量（X，pmol）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.8667X+0.3613（R2=0.9997）。結(jié)果表明，SAH 進(jìn)樣量在5～100 pmol 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度及穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.1.2 項(xiàng)下濃度為1.25 μmol/L的SAH對(duì)照品溶液40 μL，分別于開(kāi)始（0 h）、中間（5 h）和結(jié)束（10 h）時(shí)按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定2次。結(jié)果SAH峰保留時(shí)間和峰面積平均值分別為3.96 min和43.57，RSD分別為0.11%和0.33%（n=6）。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為2020010192）適量，按2.1.2項(xiàng)下酶反應(yīng)溶液制備方法平行制備6份供試品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。結(jié)果isoAsp 含量的平均值為3.46 nmol/mL，RSD為5.10%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取2.1.2項(xiàng)下酶反應(yīng)溶液與SAH對(duì)照品溶液各30 μL，混勻，即得添加SAH 對(duì)照品濃度分別為0.25，0.75，1.25 μmol/L 的低、中、高水平加樣回收溶液，平行3 份，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定SAH的含量，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

靈敏度考察：取2.1.2 項(xiàng)下SAH 對(duì)照品溶液（濃度為0.125 μmol/ L），按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果色譜峰的信噪比（S/N）為15.9，符合定量要求。

2.2 法定標(biāo)準(zhǔn)A21 脫氨人胰島素測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate?XB - C18柱（100 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：以0.2 mol/ L 硫酸鹽緩沖液（取無(wú)水硫酸鈉28.4 g，加水溶解，加磷酸2.7 mL、水800 mL，用乙醇胺調(diào)pH 至2.3，加水至1000 mL）- 乙腈（82∶18，V/V）為流動(dòng)相A，以乙腈-水（50∶50，V/V）為流動(dòng)相B，梯度洗脫（程序見(jiàn)表3）；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

表3 梯度洗脫程序（%）Tab.3 Gradient elution procedure（%）

2.2.2 溶液制備

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液：取重組人胰島素標(biāo)準(zhǔn)品，加0.01 mol/L 鹽酸溶液溶解，稀釋成每1 mL 含1 mg 的溶液，室溫放置至少24 h。

供試品溶液：取重組人胰島素注射液，每1 mL中加9.6 mol/L鹽酸溶液3 μL，即得（相當(dāng)于人胰島素70 μg）。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取2.2.2 項(xiàng)下系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例使重組人胰島素主峰的保留時(shí)間約為25 min，重組人胰島素峰和A21脫氨人胰島素峰（與重組人胰島素峰的相對(duì)保留時(shí)間約為1.3）的分離度不小于1.8，拖尾因子不大于1.8。另取2.2.2 項(xiàng)下供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，除去苯酚峰或間甲基苯酚峰，按峰面積歸一化法計(jì)算A21脫氨人胰島素含量。色譜圖見(jiàn)圖2。

2.3 樣品含量測(cè)定

對(duì)不同批次的樣品蛋白進(jìn)行isoAsp與A21脫氨人胰島素含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 isoAsp和A21脫氨人胰島素含量測(cè)定結(jié)果Tab.4 Results of content determination of isoAsp and A21 desamido human insulin

3 討論

隨著生物技術(shù)藥物在我國(guó)的發(fā)展，蛋白藥物的質(zhì)量控制越來(lái)越嚴(yán)格，脫酰胺化越來(lái)越受到關(guān)注［1］，關(guān)于蛋白藥物中isoAsp的研究越來(lái)越多［8-10］。isoAsp的產(chǎn)生是動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程［11-14］，建立準(zhǔn)確、定量的檢測(cè)方法非常必要。

本研究中應(yīng)用IsoQuant?定量試劑盒中的PIMT 催化SAM 上的甲基移至樣品蛋白中isoAsp 的羧基上，而SAM 轉(zhuǎn)變?yōu)镾AH［1］，反應(yīng)中SAM，SAH，isoAsp 的摩爾比為1∶1∶1，即可通過(guò)測(cè)定SAH 而測(cè)定蛋白中isoAsp。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，需特別注意溶液配制、酶反應(yīng)操作過(guò)程的精確度。重組人胰島素注射液和isoAsp -DSIP 質(zhì)控對(duì)照溶液中SAH 含量均在5～100 pmol 線性范圍內(nèi)；加入isoAsp - DSIP 質(zhì)控對(duì)照溶液（濃度為3.84 μmol/ L，理 論 值 為25.63 pmol），其 平 均 值 為27.80 pmo（l+8.5%），符合要求（±10%）。本研究中所建立的方法操作簡(jiǎn)便、測(cè)定快速、檢測(cè)有效、結(jié)果準(zhǔn)確。

曾對(duì)重組人胰島素對(duì)照品中的isoAsp進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果未檢測(cè)到。可能原因是對(duì)照品為粉末，在-18 ℃溫度下于棕色瓶中保存，脫酰胺化不易發(fā)生；重組人胰島素注射液中檢測(cè)到isoAsp，樣品為液體，且保存條件通常為2～8 ℃，易發(fā)生脫酰胺化。由表4 可知，2 批重組人胰島素注射液蛋白中isoAsp 含量測(cè)定結(jié)果高于藥典方法測(cè)得A21脫氨人胰島素含量，表明重組人胰島素注射液中發(fā)生脫酰胺的位點(diǎn)除Asn21 外，還存在其他位點(diǎn)［15］，該結(jié)果是對(duì)制劑中蛋白脫酰胺化程度的整體評(píng)價(jià)。isoAsp不同于脫氨人胰島素，現(xiàn)行法定檢驗(yàn)方法有關(guān)物質(zhì)A21脫氨人胰島素不能真實(shí)反映重組人胰島素注射液中蛋白的脫酰胺化程度，更不能表達(dá)isoAsp的情況。

綜上所述，所建立的方法能較全面地反映重組人胰島素注射液中胰島素蛋白脫酰胺化后產(chǎn)生isoAsp 的含量，可作為法定標(biāo)準(zhǔn)中雜質(zhì)A21脫氨人胰島素檢驗(yàn)的補(bǔ)充，以更好地控制其質(zhì)量。