比較蛋白質組學在周圍神經感覺束和運動束鑒別中作用的實驗研究

孟憲宇， 路來金， 陳煥新

周圍神經損傷是臨床上的常見病、多發病、也是疑難病，患者多為青壯年，常繼發于切割傷、車禍傷、工礦事故傷，遠期高殘障率是困擾國內外醫生的難題。目前中國周圍神經損傷后殘障患者數量接近2000萬，且以每年近200萬人次的速度遞增。如何有效修復周圍神經損傷，是公共衛生領域迫切需要解決的問題，也是我國及全球范圍內社會經濟發展的重大需求[1]。

周圍神經的混合束包含感覺束與運動束，受創傷致斷裂后，臨床醫生只能憑經驗盲目地吻合斷裂的神經遠近端，很多情況下錯誤地將感覺束和運動束、運動束和感覺束對端縫合在一起，術后神經功能的障礙或喪失給患者造成巨大的痛苦，迄今為止，還沒有臨床術中可用的鑒別神經功能束的方法[2]。標記是鑒別的方法，而標記的前提是找到組成上的相對特異。周圍神經的感覺束與運動束到底有沒有組成上的差異，至今還沒有應用比較蛋白質組學進行篩選周圍神經感覺束與運動束不同時間點的差異蛋白的相關研究或報導，本課題組應用比較蛋白質組學用于篩選感覺束與運動束的特異蛋白，報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 鼠齡6 w、體重250～280 g，雄性，健康清潔級Wistar大鼠，由吉林大學基礎醫學院實驗動物中心提供。術前、術后在標準條件下飼養，溫度22 ℃～26 ℃，12 h間隔照明，自由飲水攝食。所有動物實驗都符合國際實驗動物使用指導規范的章程，且得到吉林大學動物實驗中心的批準。

1.2 試劑與儀器 蛋白定量試劑盒，除雜質試劑盒，Cy2、Cy3、Cy5熒光染料，兩性電解質等，皆為Amersham Bioscience公司產品。熒光定量PCR通用試劑盒，為北京博奧生物公司產品。Ultrospec 3300 Pro分光光度，EttanIPGphor等電聚焦儀，EttanDALT Six電泳系統(GE)，Typhoon系列多功能激光掃描成像系統(GE)，凝膠圖像掃描儀(GE)，DeCyder差異分析軟件，Ettan picker斑點切膠儀，Ettan picker點樣儀，Ettan MALDI-TOF質譜儀等皆為GE-Healthcare-Biosciences。

1.3 周圍神經新鮮與陳舊性損傷動物建模 30只Wistar大鼠，10只為一組，分為3組。3組同時取材，以實現同一時間段切取同一大鼠相應組織。按照0.3 ml/100 g體重的比例給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉。鼠面向上固定于解剖顯微鏡下，雙下肢互成90°略帶張力展開固定。無菌條件下取骼腹股溝斜行切口，鈍性分離暴露股神經，股神經運動支(運動束)長約6 mm，直徑約2 mm，恒定分為3束，用顯微鑷子觸碰有明顯肌顫反應，在入肌處銳性剪斷,得到約5 mm的股神經運動支。股神經在骼腹股溝處分出隱神經(感覺束)，隱神經剛分出時直徑約1 mm，向遠端走行逐漸變細，在髕骨下逐漸移行于皮下支配皮膚，把髕骨下緣作為標志向遠端游離，得到約5 mm的隱神經。在手術顯微鏡下自主干分出處銳性剪斷運動支，在髕骨下銳性剪斷隱神經，造成周圍神經股神經運動支和隱神經Sunderland V損傷的動物模型(見圖1)。取下的股神經運動支和隱神經分別放置保存管中并做好標記，迅速投入到液氮中,保存于-80 ℃冰箱中備用。

Wistar大鼠正常股神經運動支和隱神經顯露和取材(A～C)；Wistar大鼠股神經運動支和隱神經Sunderland V損傷8 h模型制備和取材(D～F)；Wistar大鼠股神經運動支和隱神經Sunderland V損傷8 d模型制備和取材(G～I)圖1 Wistar大鼠周圍神經模型制備及取材

1.4 實驗處理 神經組織解凍后,分別取每個樣本約300 mg的組織塊，保證每個樣品最終能提取蛋白質1 mg以上。DIGE樣品的純化，DIGE樣品的定量，蛋白樣品分別來自6種神經組織樣本，其中每種神經組織樣本都分3組，每種樣品進行3次重復,共計18組神經組織蛋白樣本,分別避光進行Cy2、Cy3、Cy5熒光標記。pH保持在8.0～9.0，蛋白質與熒光染料比例為50 μg∶400 pmol。Cy2顯黃色，Cy3顯紅色，Cy5顯藍色熒光，每次同時進行6塊凝膠電泳。第一向等電聚焦(IEF)電泳和SDS-PAGE電泳后，凝膠圖像采集與分析，用Typhoon9400激光掃描儀在熒光模式下進行Cy2、Cy3、Cy5成像掃描，所有的成像在1000 μm處行預掃描,Cy3、Cy5、Cy2標記的成像分別由532 nm、633 nm、488 nm的激發波長收集，終圖像使用100 μm的精度掃描。分析膠熒光差異凝膠電泳，用BVA軟件分析顯示9塊凝膠平均分離1586個蛋白點,蛋白點匹配率約為82%，表達量上調或下調超過1.5倍的蛋白定義為差異表達蛋白，共160個。分析膠上的差異蛋白點與考染的制備膠上的6個蛋白點進行匹配后再切取蛋白點并進行質譜鑒定。應用肽混合物的肽質量指紋譜(peptide mass fingerprinting,PMF)分析結果，應用Mascot (http://www.matrixscience.com)搜索引擎在NCBInr數據庫進行檢索。結果的可靠性用肽段匹配率的得分值和匹配肽段在對應蛋白內序列的覆蓋率進行評價(見圖2)。

Master No.是該差異蛋白在膠中的號碼；等電點及分子量是根據PMF得到的蛋白質的理論值；Coverage是已配對多肽與蛋白總序列的比值百分比；t-test是軟件應用的統計學方法；Av-Ratio是差異蛋白在相對比的組中的升高或降低的比值圖2 大鼠正常股神經運動支(CM)和隱神經(CS)、Sunderland V損傷后8 h股神經運動支(SIM)和隱神經(SIS)、Sunderland V損傷后8 d(LIM)和隱神經(LIS)3種時間點的比較蛋白質組學質譜鑒定出的高差異蛋白

2 結 果

周圍神經感覺和運動束之間差異表達的蛋白共160個，選取6個高差異蛋白點分析鑒定，Annexin V、NF-L、Tec、Serpina3n、PRDX-2、TPM1蛋白被確切地鑒定。其中的1399號蛋白點Annexin V穩定出現與各膠中，CM/CS的比值是-1.94倍，匹配良好，蛋白穩定出現在所有膠中，P值0.00068,具有統計學意義；SIM/SIM的比值是-2.07倍，匹配良好，蛋白穩定出現在所有膠中，P值0.0053，具有統計學意義；LIM/LIS的比值是-2.20倍，匹配良好，蛋白穩定出現在所有膠中，P值0.0069，具有統計學意義。采用實時定量Rt-PCR的方法，檢測比較蛋白質組學和質譜分析鑒定出的周圍神經感覺和運動束之間在不同時間點損傷的高差異蛋白在mRNA水平的變化，驗證蛋白質組學的鑒定結果(見圖3)。

a：Annexin V蛋白引物序列；b：Annexin V 在正常運動束(CM)與正常感覺束(CS)mRNA表達水平；c：Annexin V 在Sunderland V新鮮損傷8 h運動束(LIM)與感覺束(LIS)mRNA表達水平；d：Annexin V 在Sunderland V陳舊損傷8 d運動束(SIM)與感覺束(SIS)mRNA表達水平圖3 蛋白質組學結果的Rt-PCR驗證，Annexin V是周圍神經感覺和運動束之間在不同時間點損傷后的高差異蛋白

3 結 論

周圍神經感覺束和運動束之間的比較蛋白質組學表達存在明顯差異,Annexin V可作為鑒別周圍神經感覺和運動束的高差異標記蛋白。

4 討 論

周圍神經損傷后，功能恢復不佳的主要原因是接觸導向理論模式下的對位精準性差，這在周圍神經損傷的最重分型，即Sunderland V損傷表現最為明顯，所以本實驗采用了Wistar大鼠股神經肌支和隱神經的Sunderland V損傷模型。現今，微創化手術要求束膜縫合，而束膜縫合的前提是能夠鑒別神經功能束的性質，但迄今還沒有實用的神經功能束鑒別方法。

國內外學者曾經提出電刺激法或近紅外光譜法進行鑒別，但電刺激法術中鑒別的缺點是患者需保持清醒，麻醉受到限制，電位不穩定，不適于術中應用[3]。酶組織化學法(膽堿酯酶AchE和碳酸酐酶CA)鑒別周圍神經束性質，一度被認為是突破此難題的方法，但需實驗室操作，時間過長，而且操作步驟極其繁瑣，非實驗人員無法完成。AchE和CA都不是神經組織的特異性標志酶，缺乏特異性，酶染方法自身的缺陷難以在臨床上應用[4]。

近幾年，神經特異蛋白免疫學方法給周圍神經功能束鑒別帶來了希望。標記是鑒別的方法，而標記的前提是找到組成上的相對特異。免疫學方法鑒別周圍神經束性質在理論上是切實可行的，但文獻回顧中提到一些蛋白在周圍神經感覺或運動束的特異性上受到很多專家的質疑，如何選擇一種高通量篩選周圍神經干感覺束與運動束的實驗方法來進行研究，是周圍神經干感覺束與運動束鑒別的焦點問題。我們通過應用比較蛋白質組學的方法結合質譜及蛋白質數據庫，對周圍神經運動束與感覺束的蛋白質進行整體對比分析,找出周圍神經運動和感覺束的特異性或高差異性蛋白質,為臨床周圍神經運動和感覺束快速鑒別提供新手段。

本實驗應用高通量的比較蛋白質組學,篩選出了6個差異在1.5倍之上的蛋白，其中Annexin V不僅在正常周圍神經運動束與感覺束中存在-1.94倍的高差異，在新鮮周圍神經損傷后運動束與感覺束中存在著-2.07倍的高差異，而且在陳舊性周圍神經損傷后運動束與感覺束中存在-2.20倍的高差異，Rt-PCR也驗證Annexin V確實在周圍神經感覺束與運動束中存在較大差異。通過Annexin V在周圍神經感覺束與運動束中2倍左右的高差異比例，證明Annexin V是個可用于周圍神經運動束和感覺束鑒別的高差異蛋白。這就為周圍神經新鮮與陳舊性損傷后的鑒別提供了可標記的高差異蛋白，有可能實現免疫組化法進行術中快速的周圍神經束性質鑒別。

Annexin V是一種膜聯蛋白，生理情況下具有促進髓鞘形成、樹突生長、神經元修復及維持突觸可塑性等重要功能，在神經再生和修復中起著重要作用[5]。本實驗在Wistar大鼠股神經運動支和隱神經損傷后Annexin V持續表達，并在量上變化較大，驗證了其在髓鞘再生和軸突生長免疫調節修復過程中起著重要作用。現今國外對于Annexin V在Alzheimer病(AD)、精神分裂癥、抑郁癥、多發梗死性癡呆、帕金森病、原發進行性失語癥、Lewy小體型癡呆、唐氏綜合癥、輕度認知功能損傷等中樞系統疾病上論述較多,但在周圍神經系統損傷及疾病方面研究較少[6]。現今納米粒因為體積微小和優良發光屬性而成為最優良的蛋白標記物[7]。應用發光效率好且容易制備的碲化鎘(CdTe)納米粒，把CdTe納米粒與Annexin V蛋白抗體相耦連，制備出常溫下穩定可備用的CdTe-Annexin V抗體復合物，作用于感覺束上的抗原，使抗原和抗體結合，利用CdTe納米粒的發光性標記出感覺束，實現周圍神經感覺束和運動束的鑒別，進而實現神經斷端感覺束與感覺束、運動束與運動束的準確對接束膜縫合，達到降低周圍神經斷裂損傷后的肢體殘障率，真正惠及眾生，造福于民。

Annexin V能否用于抗原抗體免疫反應發光標記以實現周圍神經功能束鑒別和Annexin V和發光偶聯物的相容性問題是個后續的科研方向。本研究突破傳統的周圍神經感覺束與運動束在單一時間點鑒別的觀念，積極探討周圍神經感覺束、運動束損傷后不同時間的蛋白量的變化，將會推動周圍神經功能束鑒別以及周圍神經損傷修復的進一步研究。