胱抑素C對缺血再灌注損傷大鼠腦水腫和微血管的影響

陳 萌, 梁秀軍， 王江南， 馬凱旋

腦血管疾病是一種常見的中樞神經系統疾病，該病嚴重威脅人類的健康。它的基本病理變化是發生腦缺血再灌注損傷，損傷后血腦屏障(blood brain-barrier,BBB)通透性增高，導致血漿蛋白和水分外滲引起血管源性腦水腫和繼發性出血改變[1,2]。有研究表明BBB的通透性和基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinases-2,MMP-2)之間存在密切的關系[3]。血腦屏障的完整性是防止血管源性腦水腫的基礎，如果BBB的結構和功能失調將導致繼發的細胞外腦水腫[4,5]。水通道蛋白4(aquaporin,AQP4)是腦內最主要的特異性水通道蛋白，與滲透壓調節、腦脊液的重吸收和腦水腫形成的生理、病理過程密切相關[6]。近年來發現胱抑素C(cystatin C,Cys C)參與了腦血管系統的病理和生理過程[7]。因此，本研究設計動物實驗，應用Cys C干預腦缺血再灌注大鼠，觀察效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及處理 成年雄性SPF級SD大鼠100只，體質量260～280 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為SCXK(京)2016-0011。將大鼠隨機分為假手術組、缺血再灌注組、Cys C低、中、高濃度組，每組20只。所有大鼠術前禁食12 h，Cys C組于術前60 min鼠尾靜脈分別注射Cys C(2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L)，假手術組和缺血再灌注組注射等量生理鹽水。

1.2 藥品與試劑 藥物Cys C(Enzo life Sciences，瑞士)，兔抗AQP4多克隆抗體(Santa Cruz，美國)，兔抗MMP-2多克隆抗體(Arigo，臺灣)，小鼠抗β-actin抗體(北京中杉金橋公司)，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的羊抗兔IgG(KPL，美國)，HRP標記的羊抗小鼠抗體(北京中杉金橋公司)，BCA蛋白定量試劑盒(杭州聯科生物技術股份有限公司)，兔SP檢測試劑盒、PBS緩沖液干粉(北京索萊寶生物科技有限公司)，檸檬酸鹽修復液(北京中杉金橋公司)。ECL Western blot發光液(北京普利萊基因技術有限公司)。2636A4型線拴(北京泰科蘭博生物技術有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物模型制備 各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后固定在手術臺上。缺血再灌注組和Cys C各組采用Zea-Longa改良線栓法[8]制備右側局灶性腦缺血再灌注損傷模型。假手術組僅分離頸總、頸內和頸外動脈，不插入線拴。術后大鼠單籠飼養，燈照保暖。缺血2 h后拔出線拴至頸外動脈殘端實現再灌注，各組大鼠于再灌注24 h后進行取材。術后大鼠出現右眼瞼下垂，行走時向左側轉圈或傾倒，提尾時左前肢屈曲內收為模型成功標準。

1.3.2 腦組織含水量測定 采用干濕重法。每組取6只大鼠麻醉后迅速取腦，去除小腦和腦干后，分別處理右側大腦。用電子天平秤其濕重后，置于60 ℃烤箱中烤干至恒重，腦組織含水量計算公式：(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.3 BBB通透性測定 采用伊文思藍(EB)作為示蹤劑測BBB的損傷程度。各組取6只大鼠，經大鼠尾靜脈注入2%的EB(2 ml/kg)，大鼠球結膜、皮膚等部分變藍表示注射成功。取缺血再灌注側腦組織秤濕重后放入甲酰胺溶液(每100 mg腦組織加入1 ml 甲酰胺)中，60 ℃水浴孵育24 h，取出5000 r/min 離心20 min，取上清10000 r/min再次離心10 min，取上清200 μl加入酶標板測定其630 nm處的吸光度。甲酰胺溶液做空白對照，腦組織EB含量計算公式：腦組織EB含量(μg/g腦組織)=待測樣品EB含量(μg/ml)×甲酰胺量(ml)/腦濕重(g)，待測樣品EB含量根據標準曲線回歸方程求得。

1.3.4 Western blot檢測損傷腦皮質組織中AQP4蛋白表達 將每組3只大鼠用10 %水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后于冰上切取損傷側腦皮質組織，Sham組取同側對應部位新鮮腦皮質組織。加入1 ml RIPA裂解緩沖液，冰上勻漿，12000 r/min離心15 min，取上清。BCA法蛋白定量，計算蛋白濃度。蛋白定量后按照4∶1加入5×SDS buffer，95 ℃煮沸5 min 變性，迅速冰浴，-80 ℃保存。每孔40 μg蛋白上樣，經過SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉，分別加入TBST稀釋的一抗：兔抗AQP4(1∶1000)、小鼠抗β-actin(1∶1000)，4 ℃孵育過夜。次日洗膜后分別加入HRP標記的山羊抗兔二抗(1∶5000)和羊抗小鼠(1∶2000)室溫孵育1 h。將顯色劑按說明書比例配制，振蕩器搖勻，顯影，以β-actin作為內參照。應用Image-Pro-Plus 6.0軟件分析目的條帶的灰度值，以AQP4條帶與對應 β-actin條帶的積分光密度(Integral optical density,IOD)比值作為AQP4蛋白的相對表達量。

1.3.5 免疫組化法檢測腦皮質組織MMP-2的表達 每組3只大鼠用4%多聚甲醛固定大腦24 h，腦組織常規石蠟包埋后冠狀切片(片厚5 μm)。按照試劑盒說明書進行實驗，用稀釋液將一抗兔抗MMP-2多克隆抗體按(1∶100)稀釋，滴加稀釋的一抗37 ℃ 孵育1 h。PBS洗滌3次，每次2 min。滴加Bio-羊抗兔IgG工作液，37 ℃ 孵育30 min。PBS洗3次，每次2 min。滴加鏈霉親和素-POD工作液，37 ℃ 孵育30 min。PBS洗4次，每次5 min。DAB室溫顯色，鏡下控制反應時間。蒸餾水洗終止反應。顯微鏡下觀察并拍攝5個400倍互不重疊視野的照片，Image-Pro Plus 6.0軟件圖像分析，免疫反應強度以平均光密度(OD)值表示。

1.3.6 透射電下觀察大鼠血腦屏障超微結構 取大鼠右側損傷腦皮質細切成1 mm3的小塊，投入到預冷的3.1%戊二醛固定液中前固定2 h，緩沖液漂洗后浸入后固定液中1.5 h。常規透射電鏡生物樣品處理。超薄切片機下切取厚度為70 nm的薄片。醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察各組大鼠腦皮質血腦屏障的超微結構。

1.3.7 掃描電鏡下觀察大鼠腦皮質毛細血管表面形貌 取右側腦組織行冠狀切，取10 mm左右的厚片用緩沖液充分漂洗后梯度脫水。經叔丁醇干燥后離子濺射鍍膜，在掃描電鏡下觀察各組大鼠腦組織的毛細血管開放情況及其周圍組織的形態結構。

2 結 果

2.1 Cys C對缺血再灌注大鼠腦組織含水量的影響 缺血再灌注組大鼠腦組織含水量較假手術組明顯增加(P<0.01)；Cys C低、中濃度組腦組織含水量較缺血再灌注組有顯著減少(P<0.01)，而Cys C高濃度組含水量較低、中組明顯增加(見表1)。

表1 各組大鼠腦組織含水量、EB含量的比較

2.2 Cys C對缺血再灌注大鼠腦組織BBB通透性的影響 缺血再灌注組大鼠BBB通透性較假手術組顯著增高(P<0.01)；Cys C低、中濃度組大鼠BBB通透性較缺血再灌注組明顯降低(P<0.01)，而Cys C高濃度組BBB通透性明顯增高(P<0.01)(見表1)。

2.3 Cys C對缺血再灌注大鼠腦皮質AQP4表達的影響 Western blot 結果顯示：假手術組有少量AQP4表達(0.88±0.08)，缺血再灌注組AQP4表達為(1.77±0.12)，較假手術組顯著升高(P<0.01)；Cys C低、中濃度組AQP4表達分別為(1.33±0.06)、(1.20±0.06)，較缺血再灌注組明顯降低(P<0.01)；而Cys C高濃度組AQP4表達(1.62±0.11)，較低、中濃度組明顯增高(P<0.01)(見圖1)。

圖1 各組大鼠腦皮質組織AQP4 蛋白印跡結果

2.4 Cys C對缺血再灌注大鼠腦皮質組織MMP-2表達的影響 免疫組化染色顯示陽性為細胞漿出現棕黃色顆粒，主要表達于纖維母細胞、內皮細胞和大腦皮質神經細胞的胞漿和近胞膜處。檢測各組腦皮質組織MMP-2表達的OD值，缺血再灌注組MMP-2表達的OD值為0.242±0.013，明顯高于假手術組0.156±0.008；Cys C低、中濃度組MMP-2表達的OD值較缺血再灌注組有不同程度的降低，分別為0.201±0.011和0.179±0.009，差異有統計學意義(P<0.05)。而Cys C高濃度組MMP-2的OD值為0.248±0.024，較低、中濃度組明顯增高(P<0.05)(見圖2)。

A：假手術組；B：缺血再灌注組；C：Cys C低濃度組；D：Cys C中濃度組；E：Cys C高濃度組圖2 各組大鼠腦皮質MMP-2免疫組化染色結果(×400)

2.5 Cys C對缺血再灌注大鼠BBB形態結構的影響 假手術組毛細血管內皮細胞呈扁平梭形，其核膜、核仁形態規則，核內染色質密度均一。基膜完整、清晰，厚薄均勻；缺血再灌注組有毛細血管腔明顯狹窄，周圍可見有大片胞質溶解空白區；內皮細胞明顯水腫，部分基膜發生溶解、疏松或分層。Cys C低濃度組較缺血再灌注組胞質溶解空白區明顯減少，毛細血管基膜溶解有明顯的改善，部分內皮細胞發生水腫；Cys C中濃度組毛細血管較為通暢，內皮細胞稍有水腫，管腔中可見有紅細胞。而Cys C高濃度組毛細血管內皮細胞大量溶解，殘存的內皮細胞線粒體發生空泡變性，星形膠質細胞明顯腫脹，胞質有大量溶解空白區(見圖3)。

A：假手術組；B：缺血再灌注組；C：Cys C低濃度組；D：Cys C中濃度組；E：Cys C高濃度組圖3 各組大鼠腦皮質組織血腦屏障的超微結構(×20000)

2.6 Cys C對腦缺血再灌注大鼠腦微血管開放情況的影響 假手術組毛細血管基本正常開放，腦皮質組織結構清晰。缺血再灌注組有大片毛細血管管腔明顯閉塞，腦組織結構紊亂損傷嚴重。Cys C低、中濃度組毛細血管張開數量較缺血再灌注組明顯增多且較為通暢，腦組織損傷程度較缺血再灌注組有明顯改善。而Cys C高濃度組大部分毛細血管管腔閉合，僅少數開放，腦皮質組織結構較為紊亂(見圖4)。

A：假手術組；B：缺血再灌注組；C：Cys C低濃度組；D：Cys C中濃度組；E：Cys C高濃度組圖4 各組大鼠腦組織微血管的超微結構(×500)

3 討 論

AQP4存在于腦組織星形膠質細胞的表面，而星形膠質細胞也是構成血腦屏障的主要細胞。所以AQP4是介導水分子進出血腦屏障的非常重要的蛋白[9]。血腦屏障的破壞程度與AQP4的表達上調密切相關。AQP4的表達增強是膠質細胞的適應性反應，促進了血管源性腦水腫的發生。王秀輝[10]等在研究大鼠腦缺血/再灌注后AQP4的表達與腦水腫的關系時發現：24 h內隨著時間的推移，AQP4表達水平不斷升高，24 h達到最高峰；而腦含水量同樣隨著時間的推移而不斷升高，并在24 h到達最高峰，兩者變化的趨勢基本一致。我們在實驗中發現，再灌注24 h后缺血再灌注組腦皮質組織AQP4蛋白的表達顯著升高，其腦組織含水量也有明顯增高的趨勢。在應用不同濃度的藥物Cys C預防性處理大鼠后，Cys C低、中濃度組AQP4蛋白表達較缺血再灌注組明顯降低(P<0.01)；而Cys C高濃度組AQP4的表達較低、中組顯著增高。各組大鼠腦組織含水量的變化以及血腦屏障通透性的改變程度(EB含量)和AQP4表達的變化，它們的趨勢是基本一致的。

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一組鋅離子依賴蛋白酶，主要分為4類，其中明膠酶MMP-2、MMP-9主要降解明膠、Ⅳ型膠原等基底膜成分，參與組織損傷與修復。腦缺血再灌注后MMPs的表達增加，其中MMP-2與再灌注損傷的關系較為密切[11]。在神經組織中MMP-2以無活性前體由血管內皮細胞、膠質細胞和神經細胞分泌，它的主要作用是降解腦微血管細胞外基質，引起血腦屏障開放，通透性增加，導致血管源性腦水腫的出現[12]。Rosenberg[13]等研究證實，MMP-2和MMP-9的水解作用可破壞毛細血管緊密連接和基底膜的蛋白，這可能是其血腦屏障通透性增加的主要原因。

Cys C是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，在體內發揮著非常廣泛的作用；多種實驗表明外源性補充Cys C對腦卒中具有預防及潛在的治療價值[14]。但是提高溶酶體內Cys C的含量及活性必須把它控制在一個安全的范圍內，才能將該藥應用于神經系統疾病的治療。本實驗研究結果也顯示：給予缺血再灌注損傷大鼠預防性注射低、中濃度的Cys C可以抑制MMP-2和AQP4的表達，使腦組織水腫的程度減輕，毛細血管開放的數量明顯增多；而高濃度的Cys C 使損傷腦皮質組織MMP-2和AQP4的表達明顯增強，腦組織的含水量顯著增多，毛細血管管腔大多閉合。因此，Cys C在一定濃度范圍內干預可減輕腦缺血再灌注損傷導致的腦水腫，其發生機制可能與AQP4蛋白表達降低及MMP-2蛋白表達OD值減少有一定的關系，本實驗從形態學的角度也加以證實。若該藥物應用有效濃度來預防臨床腦水腫等相應疾病，還需要增加其他指標的檢測進行綜合性的評價。