胃癌組織中脂肪酶H 的表達情況及臨床意義

喻大軍 李志祥 王 凱

蚌埠醫學院第一附屬醫院腫瘤外科，安徽蚌埠 233000

胃癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一。胃癌的發病率和死亡率均在世界癌癥排名榜前列[1-2]，其中約43%的患者在中國，2015 年有480 000 例新患者和340 000 例死亡患者[3]。在晚期階段，胃癌只能對癥治療而不能完全治愈。因此，探索早期具有診斷價值的腫瘤標志物對于胃癌患者至關重要，可以給予個體化的治療，提高患者生存率[4]。脂肪酶H（lipase member H，LIPH）是一種編碼膜結合蛋白酶的基因，既往關于LIPH 的研究主要集中于突變及其與少毛癥的關系[5-7]。近期，關于LIPH 的研究主要是其在乳腺癌、肺癌、甲狀腺癌和胰腺癌中的意義[8-11]。本研究通過分析LIPH在胃癌組織中的表達情況和臨床病理學特征關系，探索LIPH 與胃癌預后關系。

1 材料與方法

1.1 材料

正常胃黏膜細胞GES-1 和胃癌細胞SGC-7901、AGS、MGC-803、BGC-823、MKN-45 均購自中科院細胞研究所。同時選取2014 年1 月至2015 年12 月于蚌埠醫學院第一附屬醫院（以下簡稱“我院”）行外科手術的95 例胃癌患者，收集其癌組織和癌旁組織的蠟塊標本。所有患者均診斷明確為胃惡性腫瘤，并且在進行胃癌根治術前均未接受任何形式的治療。研究前全部患者均簽署知情同意書，同意參與相關研究。研究方案由我院倫理委員會進行審核和批準。

1.2 主要試劑

鼠抗人抗體LIPH（ab192615）、β-actin（ab6276）購自英國艾博抗公司，二抗鼠抗（S0002）抗體購自美國Affinity 生物公司。RPMI-1640 培養基（11875119）、胰蛋白酶（25200072）購自美國Gibco 公司，胎牛血清（11011-8611）購自浙江天杭生物科技股份有限公司。蛋白印跡試劑盒（P0012A）及BCA 蛋白濃度測量試劑盒（P0012S）購自上海碧云天生物技術公司。

1.3 細胞及細胞培養

正常胃黏膜細胞GES-1 和胃癌細胞SGC-7901、AGS、MGC-803、BGC-823、MKN-45 細胞均使用RPMI1640 培養基進行培養。培養基按10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素配置，細胞均培養于37℃、5%CO2飽和度濕度條件下的培養箱中。當細胞生長至培養皿70%時，使用0.25%胰酶進行傳代操作，2～3 d 傳代1 次。

1.4 Western blot 法檢測LIPH 蛋白表達水平

使用RIPA 裂解液將細胞在冰上裂解30 min。在4℃、14 000 g 狀態下離心10 min，收集上清液。隨后使用BCA 法測量蛋白質濃度。使用SDS-PAGE 凝膠分離蛋白質，并通過轉膜將蛋白轉印到PVDF 膜上。將PVDF 膜封閉在含有5%脫脂牛奶中2 h。封閉結束后，使用TBS 溶液洗膜3 次，5 min/次。洗膜結束后分別與LIPH（1∶1000）、β-actin（1∶1000）一抗孵育，放入4℃冰箱中過夜。隨后將PVDF 膜與鼠二抗（1∶1000）室溫孵育2 h 并放于搖床中充分結合。最后使用ECL 顯影液對條帶進行顯影，利用暗室曝光顯影。

1.5 免疫組化檢測LIPH 蛋白

對95 例患者的癌組織和癌旁組織的蠟塊標本進行切片、脫蠟等處理。然后通過SP 法進行免疫反應，滴加一抗LIPH（1∶200），4℃冰箱孵育過夜。加二抗（1∶500），室溫孵育1 h。DAB 化學染色，蘇木精復染。酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。通過根據切片染色面積和棕黃色顆粒判斷免疫組化結果。結合統計學分析，研究LIPH 與臨床病理特征。免疫組化結果判讀：細胞漿可見棕黃色顆粒。將每張切片隨機選取5 個高倍視野（400×），按陽性著色強度和陽性細胞百分比進行評分，陽性著色強度：0 分（陰性），1 分（弱陽性，淺黃色），2 分（中等陽性，棕黃色），3 分（強陽性，褐色）。陽性細胞百分比：0 分（0%～＜1%），1 分（1%～＜25%），2 分（25%～＜50%），3 分（50%～＜75%），4 分（75%～＜100%）。免疫染色總分=陽性著色強度×陽性細胞百分比評分。總分范圍0～12 分，0～4 分為陰性，5～12 分為陽性[12-13]。免疫組化讀片結果均由兩名以上高級別病理醫師共同完成。

1.6 分組方法及隨訪

將95 例患者按LIPH 表達情況分為陽性組和陰性組，對兩組進行為期60 個月的隨訪。

1.7 統計學方法

采用SPSS 22.0 對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，比較采用t 檢驗；計數資料采用百分率表示，比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 法進行生存分析，log-rank 檢驗進行生存曲線比較。采用Cox 比例風險回歸模型進行影響因素分析。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 正常胃黏膜細胞與胃癌細胞株中LIPH 表達情況比較

胃癌細胞株MGC-803、AGS、MKN-45、BGC-823、SGC-7901 的LIPH 表達高于正常胃黏膜細胞GES-1，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖1。

2.2 胃癌患者癌組織及癌旁組織中LIPH 表達情況

免疫組化結果顯示，胃癌組織中LIPH 陽性表達呈棕色或者棕褐色，見圖2。癌組織中LIPH 陽性率高于癌旁組織，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 胃癌患者癌組織及癌旁組織中LIPH 表達情況[例（%）]

2.3 LIPH 陽性組和陰性組預后情況

隨訪60 個月，95 例患者中死亡人數74 例，累積生存率為22.1%。Kaplan-Meier 分析結果顯示，陽性組累積生存率低于陰性組，差異有統計學意義（logrank χ2=25.513，P ＜0.001）。見圖3。

2.4 胃癌患者預后的影響因素分析

單因素分析結果顯示，LIPH 表達、浸潤深度、淋巴結轉移情況、TNM 分期、分化程度均與胃癌預后相關（P ＜0.05）。多因素分析結果顯示，LIPH 表達陰性、浸潤深度T1～T2、無淋巴結轉移、TNM 分期Ⅰ期均為胃癌患者預后保護因素（HR ＜1，P ＜0.05）。見表2。

表2 胃癌患者預后的影響因素分析

3 討論

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一[14]。近些年來，胃癌患者的治療方法仍然以手術為主[15]。但是大部分患者在病程中仍然發生了遠處轉移。因此迫切需要發現一種生物標志物和治療靶點。LIPH 促進腸道吸收的脂肪酸或用作能源或能源儲備[16]。LIPH 被證明促進乳腺癌細胞增殖[17]、轉移[18]。LIPH 在肺腺癌及非小細胞肺癌患者中表達上升[19-20]。但也有研究顯示，在食管腺癌中LIPH 的高表達與患者生存時間的延長呈正相關，具有評價預后的價值[21]。本研究結果顯示，LIPH 在胃癌組織中的表達陽性率高于癌旁組織。多因素分析結果顯示LIPH 表達陰性、浸潤深度T1～T2、無淋巴結轉移、TNM 分期Ⅰ期均為胃癌患者預后保護因素，提示LIPH 可能是一種腫瘤預后的標志物。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 信號通路在調控癌癥細胞的多種生物學行為中起到重要作用[22-25]。因此，后期將選擇該通路進行預實驗，探索LIPH 調控胃癌增殖的作用機制。

綜上，LIPH 在胃癌組織中高表達，并與胃癌預后相關。檢測LIPH 表達情況為胃癌患者的治療提供新的可能。