食管鱗狀細胞癌中SFRP4 表達水平及臨床意義

黃 濱 王麗萍 林寶泉

1.聯勤保障部隊第九〇〇醫院麻醉科，福建福州 350025；2.聯勤保障部隊第九〇〇醫院心胸外科，福建福州 350025

食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是我國食管癌的主要亞型，占90%以上，5 年生存率只有15%～25%[1-2]。探索新的潛在生物標志物可能有助于提高ESCC 的診斷和治療。分泌型卷曲相關蛋白4（secreted frizzled-related protein 4，SFRP4）是分泌型卷曲相關蛋白家族的成員之一，通過調節Wnt 信號轉導通路對細胞增殖、自我更新和凋亡起重要作用[3-4]。SFRP4 表達上升促進前列腺癌的侵襲能力，且增加腫瘤術后復發風險[5-6]。本研究探討SFRP4在ESCC 細胞、血清及組織中的表達，并探討其臨床價值。

1 材料與方法

1.1 細胞系、標本

食管鱗狀上皮細胞系HET-1A 購自南京凱基生物科技發展有限公司；所有ESCC 細胞系均購自中國科學院上海細胞庫。選取2013 年3 月至2015 年4 月聯勤保障部隊第九〇〇醫院（以下簡稱“我院”）病理科存檔的160 例ESCC 及癌旁石蠟組織標本，采用免疫組織化學染色檢測SFRP4 的表達。納入標準：①病理明確為ESCC；②根治性食管癌切除手術；③臨床病理資料完整，隨訪可靠；排除標準：①腺癌；②因出血、梗阻等急診手術。收集2019 年6 月至2020 年10 月我院70 例ESCC 患者、70 例Barrett 食管患者和70 名健康體檢者的清晨空腹血清。Barrett 食管由內鏡及病理活檢診斷。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器

免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋公司，兔抗人SFRP4 多克隆抗體購自英國NOVUS 公司。

1.3 研究方法

細胞培養：使用RPMI 1640 培養基在37℃、5%CO2條件下培養細胞株，待生長至70%～80%培養皿進行傳代培養。

Western blot 實驗檢測各組細胞系中SFRP4 的表達。提取總蛋白，測定總蛋白濃度，電泳，轉膜，封閉2 h，洗膜，一抗過夜孵育，洗膜，二抗孵育，ECL 化學發光法顯影。GAPDH 作為內參。

免疫組織化學染色檢測ESCC 及癌旁石蠟組織標本中SFRP4 的表達：切片、脫蠟、水化、修復抗原、一抗4℃過夜，加二抗，顯色，復染，封片。SFRP4 陽性表達定位于細胞漿。根據染色強度和染色細胞百分比進行判定。染色強度：無染色=0 分，淺黃色=1 分，棕黃色=2 分，棕褐色=3 分；染色細胞百分比：陽性率為0%～10%=1 分，陽性率為11%～50%=2 分，陽性率為51%～75%=3 分，陽性率為＞75%為=4 分。最終評分=染色強度×染色細胞百分比，0～2 分為低表達，≥3 分為高表達。

酶聯免疫吸附試驗法檢測血清中SFRP4 的表達量：清晨空腹采集靜脈血5 ml。嚴格按照試劑盒流程進行操作。用酶標儀繪制吸光度曲線計算樣本SFRP4水平。

電化學發光法檢測癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、鱗狀細胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCCA）的表達量：收集清晨空腹靜脈血5 ml，離心后提取血清，嚴格按照說明書進行操作。正常參考值范圍：CEA＜5 ng/L，SCCA＜1.5 ng/ml。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0 對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，采用t 檢驗；計數資料采用例數和百分率表示，采用χ2檢驗。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。受試者操作特征曲線計算曲線下面積（area under curve，AUC），采用MedCalc 軟件比較AUC 的差異。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ESCC 細胞系中SFRP4 的表達

ESCC 細胞系的表達均高于食管鱗狀上皮細胞系HET-1A（P ＜0.05）。見表1、圖1。

表1 ESCC 細胞系中SFRP4 的表達（n=3，）

表1 ESCC 細胞系中SFRP4 的表達（n=3，）

注 與食管鱗狀上皮細胞系HET-1A 比較，aP ＜0.05。ESCC：食管鱗狀細胞癌；SFRP4：分泌型卷曲相關蛋白4

2.2 石蠟組織中SFRP4 的表達及與臨床病理特征的關系

ESCC 石蠟組織標本中SFRP4 的陽性率為46.9%（75/160），高于癌旁正常組織的15.6%（25/160）（χ2=36.364，P ＜0.001），見圖2。ESCC 組織中SFRP4 的陽性表達與病理分期有關（P ＜0.05），見表2。

表2 SFRP4 的表達與臨床病理特征關系（例）

2.3 不同患者血清中SFRP4、CEA、SCCA 的表達量比較

ESCC 患者血清中SFRP4、CEA 和SCCA 表達水平高于Barrett 食管和健康體檢者（P ＜0.05）。見表3。

表3 不同患者血清中SFRP4、CEA、SCCA 的表達量比較（）

表3 不同患者血清中SFRP4、CEA、SCCA 的表達量比較（）

注 與Barrett 食管患者比較，aP ＜0.05；與健康體檢者比較，bP ＜0.05。SFRP4：分泌型卷曲相關蛋白4；CEA：癌胚抗原；SCCA：鱗狀細胞癌抗原；ESCC：食管鱗狀細胞癌

2.4 血清中SFRP4、CEA、SCCA 及三者聯合檢測的診斷價值

血清SFRP4、CEA、SCCA 三項聯合檢測的曲線下面積均高于單獨檢測（Z=3.562、3.197、3.012，P ＜0.05）。見表4、圖3。

表4 血清中SFRP4、CEA、SCCA 及三者聯合檢測的診斷價值

3 討論

我國ESCC 患者初診時往往處于中晚期，整體生存率仍不高[7-9]。探討ESCC 的發病機制，對ESCC 的早期診斷、靶向治療具有重要的臨床應用價值。

Wnt 信號傳導通路是指配體Wnt 蛋白和膜蛋白受體結合激活細胞內下游通道的過程，在調控多種人體生理活動中起重要作用，Wnt 信號傳導通路失調是人類多種惡性腫瘤最常見的異常信號之一[10-11]。SFRP4基因位于7 號染色體短臂上，全長10.99 kb，由著絲粒-全端粒方向的反義鏈轉錄而成[12]。SFRP4 蛋白C端的網狀蛋白樣結構域與Wnt 配體具有親和力，通過調節Wnt 信號轉導通路參與機體的發育和內穩態功能[13-14]。近年來，SFRP4 在多種疾病（例如糖尿病、骨性關節炎等）發揮重要作用，并引起廣大學者的極大關注[15-17]。

有研究表明SFRP4 在不同惡性腫瘤中的表達不盡相同。原發性肝癌患者血清SFRP4 水平顯著高于非肝癌患者[18]。Busuttil 等[19]發現SFRP4 在胃癌組織中表達增高，與侵襲性呈正相關，可作為術后患者預后的標志物。胰腺癌組織中SFRP4 的表達水平高于癌旁正常組織，是判斷胰腺癌不良預后的獨立危險因素[20]。然而，在子宮內膜癌中SFRP4 表達下調，并與遠處轉移、術后復發有關[21]。SFRP4 在ESCC 中的表達尚未報道，本研究判斷SFRP4 與ESCC 間的關系。

ESCC 的早期診斷對患者的預后具有重要意義。血清腫瘤標志物具有方便、經濟的特點，可用于早期診斷和判斷復發的作用[22]。CEA 是一種廣譜腫瘤標志物，在ESCC、重度吸煙和肝病中均可升高[23-24]。SCCA 可用于判斷中晚期鱗狀細胞癌的預后，但CEA 和SCCA診斷ESCC 的靈敏度和特異度均較差[25-26]。本研究中，SFRP4、CEA、SCCA 三者聯合檢測的曲線下面積均高于單獨檢測，提示三者聯合監測有利于ESCC 的診斷。本研究中，所有ESCC 細胞系中SFRP4 表達量均高于食管鱗狀上皮細胞系，ESCC 患者血清SFRP4 表達量高于Barrett 食管和健康體檢者，ESCC 石蠟組織標本的SFRP4 陽性率高于癌旁正常組織，顯示SFRP4與ESCC 的發生有關。ESCC 石蠟組織SFRP4 的表達與病理分期有關，提示SFRP4 促進食管的發展和遷移。

總之，SFRP4 與CEA、SCCA 聯合檢測有利于提高ESCC 診斷的準確性，參與ESCC 的發生、發展，可作為靶向治療的重要分子標志物。