學齡期肥胖兒童尿液中小分子代謝物研究

張艷濤 陳 黎 朱一冰 王淑玲 茍小軍

1.上海市寶山區中西醫結合醫院兒科，上海 201999；2.杭州師范大學醫學部藥學院，浙江杭州 310012

在過去的30 年里，肥胖已成為一種全球流行病。在中國，隨著社會經濟的快速發展，高熱量、高脂肪的食物在兒童飲食中越來越受歡迎，這些因素已成為兒童肥胖的主要原因。因此，在中國，兒童和青少年的超重和肥胖患病率迅速上升[1]。兒童和青少年的肥胖可能會持續到成年期，更有可能在年輕時患上糖尿病和心血管疾病等非傳染性疾病[2]。兒童肥胖雖然診斷已明確，但逆轉和治療仍十分困難，治療的特效藥物選擇范圍有限，其發病機制尚不完全清楚[3]。

代謝組學是一種高通量技術，目的是鑒定和研究在某些病理代謝反應中形成的相關代謝產物，并了解疾病的分子機制[4]。代謝組學已成為人們普遍關注的研究領域，作為疾病的篩查、診斷、治療和預后的重要手段，得到了廣泛應用[5]，例如應用于臨床肝性腦病的診斷和治療[6]、妊娠期肝內膽汁淤積癥的早期診斷[7]、阿爾茨海默病的診治[8]、2 型糖尿病的診治[9]。目前，肥胖兒童尿液的代謝表型如何改變，鮮有報道。因此，本研究擬收集其尿液，應用氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC/MS）技術研究學齡期肥胖兒童和健康對照兒童的尿液代謝譜，確定尿液代謝特征和相關的代謝途徑，闡明學齡期兒童肥胖發生的生理病理機制，為預防和早期診斷學齡期肥胖兒童提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

N，O-雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺[N,O-bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide][BSTFA+1%TMCS，購自梯希愛（上海）化成工業發展有限公司，批號：B0830]；尿素酶[購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司，批號：SLBB0100V]；鹽酸甲氧胺[購自梯希愛（上海）化成工業發展有限公司，批號：M0343]。GC/MS聯用儀（7890A/5975C，Agilent Technologies）；氣相 毛細管色譜柱（HP-5MS，30 m×250 μm i.d.，0.25 μm，Folsom，CA，USA）。

1.2 研究對象

2018 年3 月至12 月，對上海市寶山區中西醫結合醫院（以下簡稱“我院”）衛生保健科中體檢的學校名單采用隨機數字表進行編號，從中隨機選取上海市寶山區實驗小學、上海大學附屬實驗學校及寶山共富實驗學校3 所學校12～15 歲兒童的體檢資料，選出12～15 歲肥胖兒童作為肥胖組（25 名），同時選取一組年齡、性別匹配的正常兒童作為正常組（25 名）。正常組中男12 例，女13 例；平均年齡（13.92±1.09）歲；肥胖組中男15 例，女10 例；平均年齡（14.04±1.08）歲。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），具有可比性。本研究得到我院醫學倫理委員會的批準，監護人簽署了知情同意書。

1.2.1 肥胖的判定 按照2004 年國際生命科學學會中國肥胖問題工作組確定的《中國學齡兒童青少年超重、肥胖篩查體重指數值分類標準》[10]判定。見表1。

表1 中國學齡兒童青少年超重、肥胖篩查BMI 分類標準（kg/m2）

1.2.2 納入與排除標準 納入標準：①年齡12～15 歲；②智力發展正常。排除標準：①病理性肥胖（繼發性肥胖）和其他疾病引起的肥胖綜合征；②有服用影響血糖、血脂和血壓的藥物史；③神經系統疾病。

1.3 研究方法

1.3.1 尿液和血清樣本采集 樣本采集前1 d 20 點以后禁食，取晨尿10 ml，3000 r/min 離心（離心半徑13.5 cm）10 min，取上清液分為2 份，-70℃冰箱凍存，待檢測。另外，空腹抽取靜脈血5 ml，于4℃冰箱靜置1 h，3000 r/min 離心（離心半徑13.5 cm）10 min，取上清液分為2 份，-70℃冰箱凍存，用于生化檢測。

1.3.2 生化檢測方法 對照管加入生理鹽水0.1 ml 和混合血清0.4 ml，試驗管編號以后分別加入谷丙轉氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）、葡萄糖（glucose，GLU）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）檢測試劑0.1 ml 和混合血清0.4 ml。采用日立全自動生化儀測定空腹血清GPT、GLU、TG、HDL、LDL 含量。

1.3.3 尿液前處理方法和GC/MS 測試條件 尿液前處理方法和GC/MS 檢測條件，參考本課題組已經發表的文章[11]。

1.3.4 數據分析 采用ChromaTOF 軟件對原始數據進行預處理，導出三維數據矩陣，然后進行除噪音、歸一化等過程。將得到的三維矩陣導入SIMCA-P11.0 軟件中進行代謝譜及代謝物分析。另外，本研究對選擇的25 名肥胖兒童和25 名正常兒童測定了其中有差異的代謝物，并確定了這些代謝物診斷兒童肥胖的價值。采用SPSS 軟件對差異代謝物繪制受試者操作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC 曲線）并計算代謝物在曲線下面積（area under the curve，AUC）。ROC 曲線下的面積可簡單、直觀地分析診斷試驗的臨床準確性，AUC 越大，診斷準確性越高，提示該項檢驗的診斷效能越大。一般認為ROC 曲線的AUC＞0.5，具有一定的診斷價值。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，比較采用t檢驗；計數資料采用例數表示，比較采用χ2檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 兩組一般資料比較

與正常組比較，肥胖組體重、身高、BMI、GPT、TG、LDL 均顯著升高，差異有統計學意義（P ＜0.01 或P ＜0.05），HDL 顯著降低，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。見圖1。

圖1 兩組一般資料比較

2.2 代謝組學結果與分析

2.2.1 代謝譜分析 為了了解兩組尿液樣本代謝譜的大致區分情況，采用無監督分析法-主成分分析法對兩組尿液代謝譜進行分析。圖2 顯示，兩組尿液樣本的代謝譜基本分離，有個別離群點。為了去除與樣品分類無關的信息，采用多維統計方法-偏最小二乘法判別分析（partial least squares-discriiminate，PLS-DA）對尿液全譜進行模式判別分析。圖3 顯示，兩組樣本代謝譜分離良好，各自聚集在一起，組內的分散度減小，并且該模型具有很高的解釋率和預測率（R2Y=0.99，Q2Y=0.95）。為了檢驗該模型是否存在過度擬合，重復性和可靠性是否良好，確保數據模型的可靠性，本研究進行了排序實驗。圖4 顯示，R2和Q2的截距分別為0.55 和-0.064，Q2的截距為負值，模型有效。以上結果提示，該模型具有較高的穩定性和重復性。

圖2 肥胖組和正常組尿液主成分分析法得分圖

圖3 肥胖組和正常組尿液偏最小二乘法判別分析得分圖

圖4 100 次排序實驗結果

基于PLS-DA 模型，依據權重系數VIP＞1（圖5），兩組變量間行t 檢驗，P ＜0.05，獲得差異性代謝物。利用NIST 數據庫和標準品數據庫（Wiley Registry）進行代謝物鑒定，鑒定了38 個代謝物，并考察了代謝物相對濃度的變化趨勢，見表2。

表2 肥胖組和正常組尿液間的差異代謝物

圖5 肥胖組和正常組尿液代謝V-Plot 圖

2.2.2 生物標志物的篩選 38 個代謝物ROC 曲線下面積計算結果顯示，18 個代謝物包括纈氨酸、草酸、苯乙胺、枯酸、甘油、磷酸鹽、異亮氨酸、蘇糖酸、胡椒酸、胸腺嘧啶、鄰苯二酚、肌酸、酪氨酸、景天庚酮糖、甘露醇、粘液酸、煙酸、尿烷酸ROC 曲線下面積均＞0.5，而且P ＜0.05，可作為早期預測兒童肥胖的重要指標。見圖6、表3。

表3 尿液代謝物預測兒童肥胖的ROC 曲線分析結果

圖6 受試者操作特征工作曲線

2.2.3 代謝通路分析 將纈氨酸、草酸、苯乙胺、枯酸、甘油、磷酸鹽、異亮氨酸、蘇糖酸、胡椒酸、胸腺嘧啶、鄰苯二酚、肌酸、酪氨酸、景天庚酮糖、甘露醇、粘液酸、煙酸、尿烷酸導入在線系統—MetaboAnalyst 中進行代謝通路分析。將閾值設置為0.10[12]，高于0.10，認為該代謝通路是潛在的代謝通路。本研究有5 種潛在的代謝通路包括（a）苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；（b）苯丙氨酸代謝；（c）甘油脂代謝；（d）酪氨酸代謝；（e）組氨酸代謝。見圖7。

圖7 MetPA 軟件鑒定的代謝通路分析圖

3 討論

本研究基于GC/MS 代謝組學技術，建立了肥胖組與正常組尿液代謝譜分析模型，證實了學齡期肥胖兒童具有的尿液代謝特征，鑒定出纈氨酸、草酸、苯乙胺等18 個代謝物，可作為診斷學齡期兒童肥胖的尿液中的潛在標志物?；贛etaboAnalyst 進行了代謝通路分析，學齡期肥胖兒童尿液中有5 種紊亂的代謝通路包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；苯丙氨酸代謝；甘油脂代謝；酪氨酸代謝；組氨酸代謝。

本研究發現纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸在肥胖組尿液中顯著升高，尤其纈氨酸相對濃度增加非常顯著。纈氨酸和異亮氨酸屬于支鏈氨基酸（branched chain amino acid，BCAAs），BCAAs 可以促進葡萄糖的攝取和骨骼肌蛋白質的合成，還可以被氧化以提供機體的能量[13]。此外，BCAAs與胰島素抵抗（insulin resis tance，IR）之間有著密切的關系，BCAAs 水平的升高可能會導致IR[14]。與肥胖相關的BCAAs 濃度升高的病因尚不完全清楚，一種可能性是肥胖患者飲食中的BCAAs 含量較高，引起IR，相反，IR 可能導致胰島素抑制BCAAs 水平的生理功能喪失[15]。營養過剩會增加BCAAs 的濃度，影響胰島素敏感性和分泌，肥胖與兒童和青少年BCAAs 濃度升高有關，BCAAs 分解代謝增加可能是生命早期出現的營養過剩的后果之一，可能導致胰島素作用的改變[15]。酪氨酸是蛋白質的組成部分，也是細胞功能的替代能源。肝臟是酪氨酸降解發生的主要器官，可產生糖異生和生酮的中間體或前體，酪氨酸代謝紊亂與多種疾病有關[16]。肝脂質代謝失調是導致IR 的危險因素，酪氨酸水平與空腹胰島素相關，酪氨酸也與肝臟的脂肪蓄積有關[17]。本研究中肥胖兒童TG 和LDL 均較正常兒童顯著升高，也驗證了這一點，提示學齡期肥胖兒童患者具有更明顯的脂代謝紊亂，可能與IR 有關。

本研究代謝組學顯示參與苯丙氨酸代謝的物質苯乙胺，在肥胖組中顯著升高。苯乙胺是一種內源性天然單胺生物堿，具有刺激作用，可導致神經遞質（多巴胺和5-羥色胺）的釋放。苯乙胺與胺相關受體結合，從而抑制多巴胺、5-羥色胺和去甲腎上腺素的再攝取[18]。肥胖癥是由能量消耗和能量攝入之間的失衡引起，中樞神經系統中的激素、肽和神經遞質在肥胖中具有潛在的作用，其通過傳入和傳出信號調節能量攝入和消耗。許多中樞作用神經遞質通過調節食物攝入和/或能量消耗而參與能量穩態。例如參與調節食物攝入量和能量消耗的神經遞質——5-羥色胺，存在于特定的弓形促黑素皮質素神經元中，這些弓形促黑素皮質素血清素受體通過改變進食行為來調節能量穩態[19]。學齡期肥胖兒童尿液中苯乙胺升高提示其食物攝入和能量消耗失衡，這些表現可能與神經遞質的代謝異常有潛在聯系。

本研究中學齡期肥胖兒童尿液中甘油的含量顯著增加，提示患者體內存在脂質代謝的紊亂。甘油參與了甘油脂代謝，而甘油脂代謝屬于脂質代謝。肥胖是以脂肪組織異常沉積和脂質代謝紊亂為特征的代謝性疾病。脂肪組織可以合成和分泌多種脂肪細胞因子，并調節葡萄糖和脂質代謝，調節胰島素的敏感性，脂肪細胞因子分泌紊亂是導致肥胖人群IR 的重要病理環節[20-21]。據報道，給予肥胖兒童運動和飲食綜合干預可以改善其脂質代謝，增加保護性脂肪細胞因子的分泌，抑制有害的脂肪細胞因子的分泌，并提高其胰島素的敏感性[22]。

兒童肥胖是全球最具挑戰性的公共衛生問題之一，兒童肥胖除了增加傳統的心臟代謝危險因素外，還會嚴重阻礙腎臟功能[23]。小兒肥胖患者的高尿酸血癥與代謝受損呈正相關[24]。尿酸是嘌呤氧化代謝分解的終產物，最終在腎臟排泄[25]。高尿酸血癥與多種疾病相關，肥胖是高尿酸血癥的重要危險因素，高尿酸血癥的發生率在肥胖人群中較高，原因可能是肥胖體質攝入過多的熱量，為嘌呤合成提供了足夠的能量并增加了尿酸的合成[26]。本研究中肥胖兒童尿液中尿酸的濃度顯著增加，可能與患者的肥胖體質有關。肌酸水平的上調也可能與體內腎小球濾過率的降低相關。另外，本研究發現草酸、枯酸、磷酸鹽、蘇糖酸、胡椒酸、胸腺嘧啶、鄰苯二酚、景天庚酮糖、甘露醇、粘液酸、煙酸等代謝物變化顯著，這些物質的生物學內涵文獻報道較少，今后，還需要進一步的研究。

總之，本研究采用GC/MS 技術對學齡期肥胖兒童和正常兒童的尿液進行檢測，結合模式識別分析了學齡期肥胖兒童尿液的代謝特征，篩選出了纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸等多種與學齡期兒童肥胖相關的潛在生物標志物。學齡期兒童肥胖的發生機制可能與苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，苯丙氨酸代謝，甘油脂代謝，酪氨酸代謝，組氨酸代謝等代謝異常有關。