基于單細胞測序數據系統分析SARS-CoV-2受體ACE2在胰腺中的表達

張立俊，于帆，陳科諺，湯希，國世星，袁新華，何海洪

南方醫科大學深圳醫院檢驗科，廣東 深圳 518110

2019 年12 月，武漢出現不明原因的肺炎患者，我國科學家通過對肺炎患者的樣本進行測序發現一種新型冠狀病毒。2020 年2 月11 日，世界衛生組織(WHO)將該病毒命名為嚴重急性呼吸系統綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)，并將此類病毒統稱為2019冠狀病毒(COVID-19)[1]。目前的疾病傳播學表明，該病毒的臨床癥狀或許不如SARS-CoV 以及MERS-CoV表現得嚴重，但其在病例數量上升速度以及傳播方式則更為嚴峻。例如，因家庭性聚集而導致的日益增加感染病例就表明了該病毒相比SARS-CoV 以及MERS-CoV更具有感染性與傳播性[2-3]。

盡管SARS-CoV-2 的病原體機制尚未查明，人們目前主要認為，與SARS 的致病原理相似，ACE2 可作為刺突糖蛋白[spike(s) glycoprotein]的受體從而允許病毒與細胞薄膜相結合[4-5]。因此，人體中表達ACE2蛋白質的細胞則更有容易被感染上SARS-CoV-2。多位學者所開展的研究表明，對于SARS患者而言，血糖水平與糖尿病分別是發病率與死亡率的預測因素[6]。根據初步報告，在感染SARS-CoV-2 的41 例患者中，有8 例患者患有糖尿病，占感染人數的20%。而鐘南山醫學小組所得的數據則表明，在173 例重癥患者之中，28 例患有糖尿病，占總人數的16.2%[7-8]。以上研究都表明，糖尿病患者更容易感染SARS-CoV-2。而在那些COVID-19 的死亡病例中，糖尿病為其第三大常見病癥[9]。

現有研究表明，ACE2 在胰腺內分泌腺體內表達較少，而其在胰腺外分泌腺體內則表達較多。此外，強陽性細胞也相對集中[10]。人們目前也需要對特定細胞進行更深一步的了解。而單細胞RNA 測序(scRNA-Seq)技術的快速發展則為人們揭示人體單獨組織中的每一細胞類型的ACE2 表達水平提供了可能，并提供了有關單細胞分辨的大量信息。目前，人們尚未針對胰腺外分泌腺細胞中的ACE2表達開展系統性的研究。

為此，本研究首先對成年人胰腺中的單細胞分辨層面的ACE2的RNA表達信息進行了研究。此外，其還利用了基因組富集分析(GESA)方法對與表達ACE2 的陽性細胞中病毒轉錄相關的基因組表達進行了分析，并對ACE2 陽性標記基因進行了基因概念網絡分析。

1 材料與方法

1.1 倫理 本研究的數據主要來源于公開數據庫，故予以豁免患者知情同意。

1.2 基因數據庫 該研究使用了單細胞表達信息數據庫(https：//www.ebi.ac.uk/gxa/sc/home)中的人體胰腺組織的單細胞測序數據來開展表達ACE2的陽性細胞的聚類分析[11]。根據初步篩選結果，對GEO數據庫中的人體胰腺導管細胞的scRNA-seq數據組進行了系統性分析，且其基因庫序列號為GSE131886。

1.3 Scanpy 軟件分析 使用Scanpy 軟件(版本1.4.6)分析整個scRNA-seq 的下游數據，其中Filter-Cells 和FilterGene 函數用于讀取過濾和作圖，而Kallisto 函數用于基因/轉錄本定量。采用t-分布隨機鄰居嵌入(t-SNE)算法降低歸一化后的標準化數據的維數，進行小區聚類，將“困惑度”值設置為20，Kinds(k)=7。細胞中的基因表達水平以每百萬計(CPM)的形式所表示，并利用CellMarker (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CellMarker)數據庫中的數據進行了比較，以識別出胰腺聚類細胞。

1.4 CellRanger 軟件分析 使用CellRanger(1.1.0版)將從每個樣本生成的原始基因表達矩陣導入R(4.0.0 版)，并使用Seurat R 軟件包(3.1.5 版)進行進一步的數據分析。在數據集中測量的基因少于200個的細胞、少于3 個細胞的基因和線粒體基因表達率大于5%的細胞被過濾。FindVariableFeatures 函數可識別在細胞之間具有高度可變表達水平的基因。主成分分析(PCA)使用Seurat RunPCA 功能進行。統一流形逼近和投影(Uniform manifold approximation and projection)非線性降維技術用于可視化和探索細胞聚類。然后，使用FindMarker函數識別用于細胞聚類的標記基因，并基于這些標記基因使用Panglao DB數據庫(https://panglaodb.se/)進行細胞注釋。

1.5 群集細胞進行基因本體(GO)功能分析 Org.Hs.eg.db(3.11.4 版)程序包和topGO(2.40.0 版)程序包(3.11.4 版)用于對群集細胞進行基因本體(GO)功能分析。分子特征數據庫(MSigDB)上的基因集富集分析(GSEA)通過presto 軟件包(版本1.0.0)和fgsea 軟件包(版本1.14.0)執行了GO 功能富集的C5 GO 基因集(版本7.0)。

1.6 基因概念網絡可視化 基于ACE2陽性細胞標記基因與疾病和基因注釋數據庫(DGA)數據資源相結合，對基因與疾病之間的基因概念網絡進行了可視化。用來進行可視化的R 軟件安裝包包括：Pathview軟件包(1.28.0版本)，Enrichplot軟件包(1.8.1版本)以及DOSE軟件包(3.14.0版本)。

2 結果

2.1 ACE2 在胰腺細胞中的表達 為了闡明ACE2 在胰腺細胞中的表達，本次實驗分析了來自單細胞表達圖譜數據庫的數據。細胞聚集后，胰腺細胞主要聚集成7種類型的細胞(圖1A)。進一步的數據分析表明，ACE2 陽性細胞主要集中在簇2 細胞中(圖1B)。通過注釋簇2細胞的細胞亞型，發現它們主要由胰腺腺泡細胞和胰腺導管細胞組成(圖1C)。比較腺泡細胞和導管細胞中ACE2陽性表達的CPM值，發現胰腺導管細胞的CPM 值高于腺泡細胞的CPM 值，差異具有統計學意義(P=0.006 1)，見圖1D。

圖1 胰腺與聚類2細胞中的ACE2陽性表達的單細胞測序細胞聚類分析

2.2 ACE2陽性細胞在腺泡細胞和導管內皮細胞中富集 采用UMAP方法對570個細胞進行細胞聚類分析。散點圖顯示總共形成了8 個簇(圖2A)。小提琴圖的結果表明，表達ACE2 的陽性細胞主要富集在簇2和簇6中(圖2B)。群集2包含100個單元(圖2C)，群集6包含36個單元(圖2D)。ACE2陽性細胞約占聚類2 細胞的1%，約占聚類6 細胞的2.8%(圖2E)。對每個細胞簇的標記基因進行計數以注釋簇(圖2F)，最后將簇2 確定為腺泡細胞，而簇6 確定為內皮細胞(圖2G、2H)。

圖2 胰腺細胞的單細胞測序分析

2.3 ACE2陽性細胞的功能富集分析 對腺泡細胞和內皮細胞標記基因進行功能富集分析的結果表明，兩種類型細胞中最富集的前5 個GO 項為SRP 依賴的共翻譯蛋白，靶向膜易位，核轉錄mRNA 分解代謝過程無義介導的衰變、翻譯起始、病毒轉錄和細胞質翻譯。

2.4 基因集富集分析(GSEA) 基于功能富集分析的結果，繼續分析腺泡細胞和內皮細胞在病毒轉錄中的潛在功能，并應用GSEA分析ACE2陽性細胞富集的途徑。結果表明，ACE2 陽性腺泡細胞中最豐富的4個基因組是靶向膜的共翻譯蛋白、胞漿核糖體、內質網蛋白質定位的建立和核糖體的結構成分(圖3A)。在對表達ACE2的陽性細胞進行GSEA分析后，前4個基因組中的3個與腺泡細胞相同，第四個基因組是內質網的蛋白質定位，內質網不是核糖體的結構成分(圖3B)。

圖3 使用了GSEA方法對ACE2陽性細胞的基因組進行了可視化處理

2.5 標記基因與疾病的基因概念網絡分析 通過分析表達ACE2 的陽性細胞的標記基因，研究人員發現，這些基因與多種胰腺炎有關。這其中，包括慢性胰腺炎、胰腺炎、急性胰腺炎和其他疾病(圖4A)。而Circos圖顯示了不同類型胰腺炎與基因之間的基因概念網絡關系(圖4B)。這其中，BNIP3、PNLIP、PRSS2、PRSS3、CLU、MUC1、ALB 與多種胰腺炎病發的聯系最為密切。對ACE2陽性內皮細胞標記基因的分析表明，這些基因與膽管癌、癌前病變、胰腺腺癌等腫瘤疾病密切相關(圖4C)。Circos圖顯示了基因與疾病之間的基因概念網絡關系(圖4D)。其中，AGR2、ISG20、HMGA1、CIB1、MMP1、S1OOP 與腫瘤的發生關系最為密切。

圖4 ACE2陽性細胞的基因-概念網絡分析

3 討論

隨著疫情的進一步蔓延，世界衛生組織也在2020年3 月11 日對COVID-19 進行了斷定，預測其為一種流行病[12]。自2020年5月以來，美國、歐洲國家、韓國、伊朗、日本和其他國家的COVID-19 患者人數急劇上升，這表明該病毒具有潛在的風險，可能會影響周圍人群的健康和生活。目前，COVID-19 的致病機制尚不清楚。有限的研究表明，它具有與SARS 相同的受體ACE2，而ACE2確實是SARS-CoV-2感染細胞所必需的分子[13]。

動物模型表明，ACE2mRNA 在患有糖尿病的實驗鼠的胰腺上高度表達，并證實了ACE2 參與糖代謝的調節[14-15]。胰腺分為兩部分，即外分泌腺與內分泌腺。其中，外分泌腺主要是由腺泡與腺管組成的，而內分泌腺則主要是由胰島組成。而胰島則主要是由4種細胞組成：A細胞、B細胞、D細胞以及PP細胞[16]。目前胰腺組織細胞的異質性相對具有典型性，而ACE2在人類不同胰腺細胞中的表達在相關研究中鮮有報道[17]。對2 209 個胰腺細胞的單細胞測序數據進行了分析。經tSNE 聚類分析，主要分為7 個細胞簇，其中ACE2則主要分布于簇2 中，而簇2 中的細胞主要由胰腺外分泌腺的腺泡細胞和導管細胞組成。2003 年爆發嚴重呼吸綜合征(SARS)時，病理解剖顯示SARS 冠狀病毒存在于患者尸體的胰腺腺泡細胞中[18]。此外，其還在動物實驗中發現，ACE2 在胰腺外分泌腺中高度表達[19-20]。進一步研究胰腺導管細胞的scRNA-seq 數據表明，ACE2 再次在胰腺腺泡細胞和內皮細胞中陽性表達，其陽性表達率分別為1%和2.8%。這些數據結果增加了人類胰腺外分泌腺也是SARS-CoV-2感染的潛在途徑的可能性。

GO分析基于胰腺腺泡細胞和導管內皮細胞的標記基因，主要富集SRP 依賴性共翻譯蛋白，靶向膜易位、核轉錄mRNA分解代謝過程、無義介導的衰變、翻譯起始、病毒轉錄、細胞質翻譯。通過分析ACE2在病毒轉錄過程中在胰腺導管細胞中的表達模式，與ACE2陰性細胞相比，ACE2陽性腺泡細胞和導管內皮細胞的基因組主要富集于靶向于膜的共翻譯蛋白、胞漿核糖體和內質網蛋白質定位的建立。這些結果表明胰腺外分泌腺易受SARS-CoV-2 感染，感染細胞在病毒轉錄中起重要作用。

通過基因-概念網絡分析，對標記基因與疾病病發率之間的相關性進行了預測，并發現BNIP3、PNLIP、PRSS2、PRSS3、CLU、MUC1、ALB基因與多種胰腺炎的病發率密切相關。而AGR2、ISG20、HMGA1、CIB1、MMP1、S1OOP基因則與腫瘤發生息息相關。這些數據表明，感染SARS-CoV-2 的胰腺外分泌腺細胞可能導致各種類型胰腺炎的發生和進展，并且可能存在腫瘤的長期潛在風險。

由多位學者所開展的研究表明，在感染SARS 冠狀病毒的患者中，ACE2 在胰腺外分泌腺和胰島細胞中均有表達[21]。因此，猜測其原因可能是不同的組織和細胞來源可能導致結果的差異或ACE2 表達的變化[22-23]。根據最新文獻，在缺氧的條件下，胰島細胞中ACE2 的表達將上調[24-26]。而COVID-19 所引起的呼吸衰竭也很有可能會導致缺氧，這意味著健康人中ACE2陰性表達的胰島細胞可能在SARS-CoV感染后引起胰島細胞中ACE2 陽性表達，但尚需進一步研究來驗證這一推測。

總之，本研究通過對單細胞測序數據的數據分析提供了生物信息學證據，證明胰腺外分泌腺可能易受SARS-CoV-2 感染。該研究表明，那些感染COVID-2019的患者應跟蹤并評估其胰腺外分泌腺功能，患者應定期監測康復后腫瘤發展的風險。

4 利益沖突

本文作者承諾本文不涉及任何利益沖突。

本研究所涉及的所有數據均可從EMBL-EBI(https://www.ebi.ac.uk/gxa/sc/home)及高通量基因表達數據庫處獲取(序列號：GSE131886)。