基于網絡藥理學對桂枝茯苓丸治療放射性肺炎的潛在作用機制初探

鄒航，李淼，何嘉寧，朱詩雨，翁文浩，趙春陽，蔡佳怡

1.中國醫科大學藥學院，遼寧 沈陽 110122；2.中國醫科大學臨床一系，遼寧 沈陽 110122；3.中國醫科大學附屬第一醫院，遼寧 沈陽 110001

隨著放射治療在腫瘤治療中的廣泛應用，隨之引起的不良反應也愈發嚴重。肺組織對放射線敏感性高，接收放射線后易發生損傷，導致放射性肺炎和長期肺纖維化的發生，嚴重影響患者預后水平和生活質量[1]。研究表明，肺癌、乳腺癌、食管癌、惡性淋巴瘤或胸部其他惡性腫瘤經放射治療后，在放射野內的正常肺組織受到損傷均會出現放射性肺炎相關癥狀[2]。因此，為了保證放射治療的順利進行，對于放射性肺炎的預防、控制與治療顯得尤為重要。

中醫將放射性肺損傷歸為“肺瘺”，主要辯證理論為熱毒之邪[3]。采用放射線治療的多為腫瘤患者，本身免疫力低下，屬于正氣不足、瘀血內結，因此應在扶正的前提下益氣活血，疏通經絡，逐淤散結。本文選擇具有臨床療效證據的理氣活血方劑桂枝茯苓丸，探索其在治療放射性肺損傷中的作用[4]。

桂枝茯苓丸出自《金匱要略》，臨床上已有其治療間質性肺炎和放射性肺炎成功的案例。桂枝茯苓丸具有改善血液流變、抗血小板聚集、調節內分泌、抗炎、鎮痛、鎮靜、抗腫瘤等作用。臨床研究證明，桂枝茯苓丸能夠降低放射性肺炎的發生率、緩解癥狀。本文通過網絡藥理學的方法初步探究其作用機制，為放射肺炎的預防與治療提供新的依據。

1 資料與方法

1.1 活性成分檢索 利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，檢索活性成分及其作用靶點(2021 年5 月31 日更新檢索)。檢索詞為“桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、芍藥”。檢索條件為口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18。初步篩選獲取活性成分，同時刪除無明確靶點的成分，然后進一步通過UniProt數據庫做標準化處理。

1.2 疾病靶點的篩選 應用在線人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)和GeneCard 數據庫對放射性肺炎的疾病靶點進行檢索，檢索詞為“Radiation pneumonitis”。檢索獲得靶點，提取Score 值，按照由高到低排列；合并兩個數據庫的檢索結果，去除重復數據。

1.3 活性成分與疾病網絡構建與分析 應用R語言中的VennDiagram程序包對成分與疾病網絡進行可視化處理。同時將成分、靶點、疾病相互作用的關系導入Cytoscape進行可視化分析。

1.4 蛋白互作網絡的構建 將桂枝茯苓丸與放射性肺炎交集基因導入String 數據庫中，生物類型設定為Homo Sapiens，得到蛋白互作網絡。

1.5 GO、KEGG 富集與分析 通過Bioconductor數據庫對篩選獲得的交集基因進行GO 和KEGG 富集。應用R 語言中DOSE[5]、ClusterProfiler[6]和Pathview[7]程序包，進行富集分析。

1.6 分子對接 應用AutoDock Vina對小分子與蛋白進行分子對接，應用Pymol 對分子對接結果進行可視化分析。

2 結果

2.1 桂枝茯苓丸活性成分及其靶點檢索 應用TCMSP 數據庫檢索獲取活性成分：桂枝7 個，茯苓15個，牡丹皮11個，桃仁23個，芍藥29個。刪除重復項和沒有明確靶點的化合物后，剩余共計85個活性成分。其中生物利用度最高的是白楊糖苷(populoside，OB=108.89%)，最低為芍藥內酯苷(albiflorin，OB=30.25%)。DL 值分布在0.19 到0.83 之間，其中去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid)類藥性最高。

2.2 放射性肺炎疾病相關靶點的篩選 應用GeneCard獲得放射性肺炎相關基因靶點531個，Score值分布在0.22～46.32。最大值46.32為TP53。同時，檢索OMIM，得到相關基因6個，合并獲得基因537個。

2.3 疾病網絡構建與分析 應用R 語言的VennDiagram程序包對成分與疾病網絡進行可視化處理，得到桂枝茯苓丸與疾病有64 個交集基因，如表1所示。其中桂枝有3個活性成分作用在3個交集基因上，茯苓有4 個活性成分作用在18 個交集基因上，牡丹皮僅有1個活性成分作用在37個交集基因上，桃仁中12個活性成分作用在同一個靶點上，芍藥7個活性成分作用在11個靶點上。

表1 益氣活血中藥與放射性肺炎基因交集

應用Cytoscape 對活性成分和靶點之間的關系進行分析(圖1)，本研究共納入放射性肺炎相關疾病靶點85 個，中藥活性成分30 個，中藥5 味，搭建關系網絡214 個，其中包括疾病與靶點、靶點與活性成分、活性成分與中藥之間的關系。其中，槲皮素(Quercetin)與37 個基因靶點相關，常春藤皂甙元(Hederagenin)與17個基因靶點相關，鞣花酸(Ellagic acid)與8個基因靶點相關，兒茶酸(Catechin)與4 個基因靶點相關，β-谷甾醇(beta-sitosterol)與3 個基因靶點相關。靶點與活性成分關聯數排首位的是PTGS2，其與23個成分存在著相關性；VEGFA、PGR、NR3C2、MPO、MMP9、GSTM1和GSTP1均與2個成分存在相關性。

圖1 桂枝茯苓丸中藥治療放射性肺炎的活性成分-靶點-通路相互作用網絡關系圖

2.4 蛋白互作網絡的構建 基于String數據庫的文本挖掘，共檢索到蛋白與蛋白之間的互作關系共計947 條，其中實驗論證的相互關系167 條(粉色)，來源于數據庫證據89 條(藍色)，共表達462 對(紫色)，基因同線7對(淺藍色)，其余黃色線為文本挖掘的基因相關性，見圖2。

圖2 桂枝茯苓丸中藥與放射性肺炎的PPI網絡

在蛋白互作網絡基因中，核心基因出現在IL-6和AKT1，分別有57 和53 個相互作用。除此之外，MMP9、CXCL8、VEGFA、IL1B、CCL2 和PTGS2 也具有較多的相關基因，分別有52、51、51、50、49 和49 個相互作用。這些靶點的預測對放射性肺炎的防治具有關鍵的指導作用。

2.5 GO富集與KEGG富集分析 通過生物活性GO 富集初步得到相關性排名前30 的生理過程，按照相關性(P值)排序，排名前十的生理活性分別為：細胞因子生理活性(cytokine activity)、細胞因子受體結合生理活性(cytokine receptor binding)、血紅素結合(heme binding)、四吡咯結合(tetrapyrrole binding)、受體配體活性(receptor ligand activity)、信號受體激活劑活性(signaling receptor activator activity)、抗氧化活性(antioxidant activity)、磷酸酶結合活性(phosphatase binding)、生長因子受體結合活性(growth factor receptor binding)、整合素結合活性(integrin binding)。為了明確桂枝茯苓丸的生物活性對應的來源，對五味中藥組分進行GO 富集，闡明其在治療放射性肺炎中可能產生的影響，見圖3。

圖3 桂枝茯苓丸中藥生物活性GO富集柱狀圖

對得到的交集基因結果進行KEGG富集，并同時對五味中藥組分進行富集分析，按P 值排名，前十的通路依次為：糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流體剪切應力與動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、脂質與動脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、膀胱癌(bladder cancer)、HIF-1 信號通路(HIF-1 signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、IL-17 信號通路(IL-17 signaling pathway)、恰加斯病相關通路(Chagas disease)、瘧疾相關通路(malaria)、前列腺癌相關通路(Prostate cancer)，見圖4。

圖4 桂枝茯苓丸中藥相關通路KEGG富集柱狀圖

2.6 分子對接 將篩選出來的小分子和蛋白分別通過AutoDock Vina 軟件進行篩選，通過計算機輔助模擬分子對接，得到8 對親和力較高的小分子與蛋白的相互作用(表2)。其中，親和力最大的是槲皮素(Quercetin)與ICAM1，親和力可達-8.9；鞣花酸(Ellagicacid)與GSTM1，親和力為-8.7；這兩個小分子與GSTP1 也有較好的相互作用。黃芩素(Baicalein)與HIF1的親和力為-7.6；Taxifolin與ICAM1和PTGS2相互作用，親和力分別為-7.6和-6.7，見圖5。

圖5 分子對接可視化圖

表2 分子對接結果

3 討論

桂枝茯苓丸出自我國著名醫學古籍《金匱要略》，由5味中藥組成，含85個活性成分。放射性肺炎共計537 個相關基因，疾病與桂枝茯苓丸活性成分相交基因64個。其中PTGS2為相互作用最多的靶點，可能為作用機制中的重要靶點。其中活性成分槲皮素、常春藤皂甙和鞣花酸與較多的靶點相關，可能為此方劑的主要活性成分。桂枝茯苓丸主要通過細胞因子生理活性、細胞因子受體結合生理活性和血紅素結合活性，進一步調節放射性肺炎相關生理過程。其機制主要通過糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路和脂質與動脈粥樣硬化通路等進行調控。

關于放射性肺炎的研究仍處于初步階段，目前放射治療后產生肺炎和肺纖維化的機制尚不明確，但關注度隨著放療患者的增加而逐年增加。2002 年XAVIER等[8]和CHEN等[9]在研究中證明了放射性肺損傷，特別是放療后期的肺纖維化與TGF-β通路有關，論證了損傷再修復機制在放射性肺炎中的重要地位。2011年YANG等[10]在International Journal of Radiation Oncology,Biology,Physics 中提出了基因多態性與放射性肺炎的關系。這些關系缺少進一步的論證，大多停留在假說的階段。為了更好的探索中藥復方在放射性肺炎中的作用，本文通過數據庫檢索篩選出所有的潛在靶點，并對不同的蛋白相互作用進行評分。但與其他常見疾病相比，本文得到的靶點Score值較低，原因可能與相關研究較少，沒有充足的證據支持有關。

中醫辨證理論在解釋放射性肺炎時存在不確定性。中醫認為放射性肺炎的主要辨證思想為熱毒，可分為以下證型：氣陰兩虛型、熱毒陰虛型、肺燥津虧型、熱毒內蘊型、肺絡血瘀型及肺腎陰虛型[11]，并沒有一個完全對應的中醫傳統理論，較為接近的是“肺痹”，因而在中醫用藥選擇上分歧較多。益氣類中藥在預防放射性肺炎的方劑中經常出現，以提高免疫力為主要功效，如參芪扶正注射液[12]。放射性肺炎本身為熱毒，有學者提出清熱解毒方劑可能存在治療意義[13]。由于放射性肺炎常表現出郁結癥狀，因而活血化瘀類藥物也成為方劑中重要組成部分，例如川芎、丹參等[14]。

桂枝茯苓丸為理氣活血方劑，主要成分為桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁和芍藥。其中桂枝為主藥，可溫通血脈，扶正固本，起到調節免疫力的作用。茯苓同為主藥，可滲利下行、益心脾之氣，有助于改善瘀血癥狀。桃仁和芍藥可清熱解毒。在成方的過程中往往加入白蜜作為輔料成丸，具有祛痰祛瘀的功效。因此，桂枝茯苓丸的功效與放射性肺炎的中醫辨證理論相一致[15]。

通過對桂枝茯苓丸-放射性肺炎通路相關性的分析，提示其藥理機制可能與細胞因子介導的炎性通路、血流動力學相關信號通路以及乏氧因子相關靶點有著密切的關系。細胞因子在非感染性炎癥疾病的發病初始階段起到關鍵的作用[16]，血細胞黏附及血流動力學改變是放射性肺炎后期肺纖維化形成的重要過程[17]，低氧誘導因子可以調節細胞對于射線的敏感度、降低肺部由于放射線引起的損傷[18]，通過調控上述過程，可能會有效抑制放射性肺炎的進展。

放射性肺炎的發生發展存在多個階段以及多個影響因素，本文首次對放射性肺炎已知研究的全貌進行總結。通過建立中藥經典復方桂枝茯苓丸的小分子庫，放射性肺炎的疾病基因庫，進一步搭建小分子、靶點、活性成分以及中藥復方之間的關系網絡，探討各組分的作用靶點及通路。目前針對放射性肺炎的中藥研究依然較少，主要集中在綜述以及文獻整理，針對機制的研究較少。本文通過網絡藥理學方法首次進行探索，旨在為放射性肺炎的中藥預防以及治療機制的探究提供新的依據。