國槐花與刺槐花中黃酮的質量差異比較

付鳳萍，高欣悅，余 佳，吳建英，余 琳，陳紅英

（西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010）

國槐花與刺槐花分別來源于豆科植物國槐（Sophora japonicaL.）和刺槐（Robinia pseudoacaciaL.）開放的花，外觀性狀特征相似，均有藥食兩用價值。在資源開發中，國槐花主要用于中藥入藥，刺槐花主要用于食品飲品［1］。兩者均含有豐富的黃酮類化合物，黃酮類化合物具有抗氧化、清除自由基、抗炎、改善血液循環、降低膽固醇等多種功效作用。在應用中，二者通常統稱為“槐花”，易發生混淆。國槐在中國歷史悠久，原產于北方，其所開放的花為國槐花，也稱槐花、槐蕊。一方面它可以直接食用，另一方面具有清熱、涼血、止血、降壓等功效而被收載于《中華人民共和國藥典》（2020 版）（簡稱藥典）［2］，與其他藥材一同煎煮，對吐血、尿血、痔瘡出血、風熱目赤、高血壓病、高脂血癥、頸淋巴結核、血管硬化、大便帶血、糖尿病、視網膜炎、銀屑病等有顯著治療作用［3］。目前，國槐花有3 種炮制方法，分別是生槐花、炒槐花和槐花炭［2］。國槐花含有多種化學成分，如蘆丁、槲皮素、鞣質、多糖類、維生素、揮發性成分等，其中黃酮類化合物蘆丁含量大于6%［4，5］。刺槐為十九世紀從國外引進的樹種，因生長快速、開花和制種能力強，能很好地適應各種環境條件，常作為綠化帶植物。刺槐所開的花叫刺槐花，又名洋槐花，香味濃烈，有清熱解毒、涼血止血、抗氧化等功效［6］，報道［7］認為該樹種的甲醇提取物對乳腺癌MDA-MB-231細胞和健康MRC-5 細胞有抗癌作用，適合作為潛在的抗腫瘤治療補充劑或營養食品補充劑。刺槐花的主要化學成分有刺槐苷、山奈酚、鞣質、蘆丁、維生素、多糖等［8］。刺槐花也是廣受歡迎的一種野菜，主要產品有槐花茶、槐花蜜和槐花糕等。

國槐花和刺槐花為同科近緣品種，外觀相似，均含豐富的黃酮類生物活性成分。藥典標準［2］中，除性狀外，槐花（實為國槐花）質量主要考察總黃酮含量和蘆丁含量。刺槐花目前尚無相應的質量標準可參考。為更好區分國槐花和刺槐花，規范相應的質量標準，試驗以中國藥典為標準，參照槐花（國槐花）的黃酮質量評價方法，分別用光譜法和色譜法對二者進行薄層色譜、總黃酮含量和蘆丁含量比較分析，以期能對2 種槐花的有效使用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

不同產地國槐花1 和2 分別購自綿陽天城大藥房、綿陽同仁堂藥店。炒槐花和槐花炭由國槐花2按照藥典［2］中槐花的炮制方法自制。野生刺槐花源于3 個不同產地的售賣品。所有樣品均由西南科技大學盧學琴老師鑒定。蘆丁對照品購自上海純優生物科技有限公司，純度≥98.0%。色譜級甲醇，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

KQ3200E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀有限公司）；T6 新世紀紫外-可見光分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；SB-2 薄層色譜儀（天津市分析儀器廠）；Kromasil 100-5 C18 色譜柱（150 mm×4.6 mm，5.0 μm）（浙江納德科學儀器有限公司）；LC-210高效液相色譜儀（上海精科儀器有限公司）；硅膠GF254薄層板（青島海浪硅膠干燥劑有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 性狀觀察 干燥后的國槐花和刺槐花適量，從顏色、氣味、外觀、水泡等方面進行比較。

1.3.2 薄層色譜鑒別

1）對照溶液制備。精密稱取蘆丁適量，用甲醇溶解配制成2.0 mg/mL 的對照品溶液。

2）供試品溶液制備。分別稱取供試品各0.5 g，加甲醇5.0 mL，超聲提取5 min，補足甲醇，取濾液作為供試品溶液。

3）用移液槍取對照品溶液和供試品溶液各5 μL，分別點于同張硅膠薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1，體積比）為展開劑，展開、晾干后，噴上1%三氯化鋁乙醇溶液，待溶劑揮發后，在365 nm紫外光燈下觀察。

1.3.3 總黃酮含量測定

1）對照品溶液制備。精密稱取定蘆丁對照品適量，用甲醇溶解配制成0.2 mg/mL 的對照品溶液。

2）供試品溶液制備。分別取各供試品粗粉約1 g，精密稱定，置于索氏提取器中，用石油醚提取至提取器中溶液為無色，棄去石油醚溶液。再用甲醇提取至提取器中溶液無色，提取液用甲醇定容至100.0 mL 容量瓶中。精密量取 5.0 mL 置 50.0 mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻。

3）比色法測定總黃酮含量。精密量取對照品溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 與 6.0 mL，分別置于 25.0 mL 量瓶中，各加水至6.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置 6 min，加氫氧化鈉試液 10.0 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應的試劑為空白，在500 nm 波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

4）供試品測定。精密量取供試品溶液3.0 mL，置于25.0 mL 量瓶中，各加水至6.0 mL，15%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，混勻，同比色法測定。

1.3.4 高效液相色譜法測定蘆丁含量

1）系統適應性試驗。C18 色譜柱（150 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相為甲醇-1%乙酸溶液（38∶62，體積比）；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長為257 nm；以0.1 mg/mL 對照品溶液為系統適用性溶液。理論板數按蘆丁峰計算應不低于2 000。

2）溶液的制備。對照品溶液：精密稱量蘆丁對照品適量，用甲醇制成0.1 mg/mL 的溶液。供試品溶液：分別稱取各供試品粗粉約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50.0 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率25 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續濾液2.0 mL，置10.0 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

3）樣品測定。精密量取對照品溶液和供試品溶液，進樣量為10 μL，應用外標法計算含量。

2 結果與分析

2.1 性狀觀察

國槐花與刺槐花外觀具有明顯差別（圖1）。刺槐花干燥花呈白色帶微綠色，完整者花萼鐘狀，花冠白色，旗瓣近圓形，體輕，氣味芳香，味甘，沸水浸泡后，溶液為淡黃色。國槐花呈棕黃色，皺縮而卷曲，花瓣多散落，完整者花萼鐘狀，黃綠色，旗瓣闊心形，體輕，味較淡微苦，沸水浸泡后，溶液呈褐色。

圖1 國槐花（左）和刺槐花（右）

2.2 薄層色譜分析

采用不同的硅膠薄層溶劑展開體系，如氯仿-甲醇-甲酸、乙酸乙酯-甲醇-甲酸、乙醇-水-冰乙酸等，以展開時間、蘆丁的比移值（Rf）和斑點形狀為指標進行選擇，最后選用乙酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1，體積比）體系展開（圖2）。由圖2 可見，2 種槐花薄層色譜圖差異明顯，①與蘆丁對照同一高度位置處，國槐花均顯示有明顯黃綠色熒光斑點，刺槐花在略高于蘆丁位置處顯示同樣顏色熒光斑點；②同種槐花不同產地薄層色譜圖無明顯差異；③在溶劑線相同高度處，國槐有明顯的熒光斑點，極性較小；而刺槐在低于蘆丁位置近1/2 處，有明顯的黃色熒光斑點，極性比蘆丁大，此外，在溶劑線處有少許紅色熒光斑點出現。

圖2 國槐花和刺槐花365 nm 處的薄層熒光色譜

從圖2 可以看出國槐與刺槐有明顯的成分差異，國槐花中的主要黃酮成分為蘆丁，但蘆丁并不是刺槐花的主要黃酮成分，據文獻報道［9，10］，刺槐花中主要黃酮成分為刺槐苷，是否為色譜圖2 中的主斑點之一，有待進一步驗證；不同產地同種槐花的薄層色譜圖差異并不大。國槐2 炮制后隨著溫度升高，由炒槐花到槐花炭，蘆丁的含量有所減少。

2.3 總黃酮含量測定

2.3.1 標準曲線 蘆丁對照溶液曲線如圖3，回歸方程為y=10.946x-0.022 7，R2=0.996 8，表明蘆丁對照溶液在濃度0.008～0.048 mg/mL 內線性關系良好。

圖3 蘆丁的標準曲線

2.3.2 總黃酮含量結果與分析 黃酮一般是有顏色的化合物，采用索氏提取法用乙醚脫掉色素干擾，再以甲醇為溶劑，對所有供試品進行總黃酮提取和比色法測定，結果見表1。結果顯示，2 種槐花中總黃酮含量均較高，以蘆丁計均大于8%［2］。國槐花總黃酮含量高于刺槐花中總黃酮含量；國槐花炮制后總黃酮含量隨著炮制溫度的升高（按照生槐花、炒槐花、槐花炭的順序）逐漸降低。

表1 國槐花與刺槐花的總黃酮含量測定結果

國槐花中總黃酮的含量測定參考文獻［2］，以蘆丁為對照，但刺槐花總黃酮測定目前尚無統一的標準方法。刺槐花中目前已知的黃酮類化合物有刺槐苷、蘆丁、槲皮素、山萘酚-3-O-β-D-半乳糖-7-O-α-L-鼠李糖苷、山萘酚-7-O-α-L-鼠李糖苷、山萘酚-3-O-β-D-半乳糖苷、山柰酚等［11］。刺槐花試驗結果與文獻［12］結論相比偏高，參照文獻［13］以刺槐苷為對照品，三氯化鋁溶液顯色紫外測定的方法得到刺槐花中總黃酮含量在3%左右，同采用藥典方法進行測定的文獻［13］報道結果基本一致。

國槐花不同炮制品有不同藥效，隨著炮制溫度升高，黃酮類部分發生轉化，藥效由清熱涼血向止血方向轉化［14，15］。本試驗結果與此一致，隨著炮制溫度升高，總黃酮含量依次降低。歷史上還記載有地黃汁炒、麩炒、新瓦上炒香熟、焙、蒸、酒浸微炒、米醋煮等多種方法［16，17］，這些具體方法是否與特定化學成分有關，有待進一步調查研究。

2.4 蘆丁含量測定結果

國槐花主要黃酮類物質為蘆丁，藥典［2］要求其含量≥6%，但刺槐花沒有相應的質量指標。鄢長余［11］在刺槐花中分離得到山萘酚-7-O-α-L-鼠李糖苷、山萘酚-3-O-β-D-半乳糖苷、D-甘露醇、麥芽酚-3-O-［6′-O-（4″-羥基-反式-桂皮酰基）］-β-D-吡喃葡萄糖苷、D-3-O-甲基肌醇、山萘酚-3-O-β-D-半乳糖-7-O-α-L-鼠李糖苷、刺槐苷等化合物，并認為其中4 個化合物（山萘酚-3-O-β-D-半乳糖-7-O-α-L-鼠李糖苷、刺槐苷、蘆丁、山萘酚-3-O-β-D-半乳糖苷）為黃酮主要成分。為方便比較，試驗統一以蘆丁為對照品，并模擬藥典一測多評法［2］，測定刺槐花中其他主峰的含量。

在系統適用性試驗中，因保留時間過長，調整流動相（甲醇∶1%乙酸，V∶V）的比例由32∶68 為38∶62，具體液相色譜見圖4。可以看出，在試驗條件下，國槐花與刺槐花色譜圖差異較大，蘆丁為國槐花的主要色譜峰，而刺槐花中明顯有3 個峰，最后1 個峰經樣品加標試驗驗證為蘆丁的色譜峰。具體保留時間與含量計算結果見表2。

表2 國槐花和刺槐花高效液相色譜測定結果

圖4 對照品和供試品液相色譜

以上結果說明，同種槐花不同產地的蘆丁有含量上的差異，但色譜圖差異不大。炮制后，隨著溫度升高，國槐花中主要成分蘆丁的含量差異較大，這與上述總黃酮含量測定結果一致。藥典要求，國槐花中蘆丁含量應大于60 mg/g，試驗中的國槐花均滿足要求，但刺槐花的含量遠低于這個標準，這也說明蘆丁不是刺槐花中的主要黃酮類成分。參照文獻［11］以甲醇-磷酸梯度洗脫，測得刺槐花中蘆丁含量為0.4%，刺槐苷1.7%，山萘酚-3-O-β-D-半乳糖-7-O-α-L-鼠李糖苷和山萘酚-3-O-β-D-半乳糖苷分別為0.4%和0.3%。

3 小結與討論

國槐花與刺槐花均含有豐富的黃酮成分，但從色譜圖明顯可見二者主要黃酮成分差異很大。蘆丁為國槐花的主要黃酮成分，而不是刺槐花的主要黃酮成分。圖2 所示薄層板在被噴上1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基溶液后，只有蘆丁對應高度位置處顯示有黃色斑點，而刺槐花無黃色斑點出現，說明其主成分清除DPPH 自由基的活性較弱。據文獻報道［9，11］，刺槐花的主要黃酮成分為刺槐苷，此化合物極性和空間位阻比蘆丁大，酚羥基比蘆丁少，結構上似乎滿足上述色譜圖條件。此試驗的刺槐花色譜圖中主成分是否是刺槐苷，有待試驗進一步考證。對于國槐花中總黃酮含量的測定，相關文獻［13］與藥典［2］均采用堿性條件三氯化鋁比色法，但刺槐花目前還無相應的質量評價標準。為方便在同等條件下與國槐花比較，刺槐花也采用此法。總黃酮測定的結果表示為刺槐花每克樣品中相當于蘆丁的含量；在高效液相色譜測定中，以蘆丁為參照，用類似于一測多評法［2］進行刺槐花中相應色譜峰的半定量的分析發現，刺槐花與國槐花都有穩定的薄層色譜圖與高效液相色譜圖，差異明顯，不同產地的同品種槐花色譜圖極為相似，僅有量上的不同。由此可見，用藥典中槐花的質量評價方法，可以有效區分國槐花和刺槐花。

國槐與刺槐為近緣品種植物，國槐主要用于中藥入藥，刺槐主要用于食品飲品。兩者均富含黃酮類生物活性物質，通常在經銷和臨床上，兩者多有混用。用藥典國槐花方法標準，兩者薄層色譜和液相色譜圖有明顯差異，國槐花總黃酮含量和蘆丁含量均高于刺槐花，但同種槐花不同產地的色譜圖差異不大，僅呈現量的差異。槐花炮制后，總黃酮和蘆丁含量有明顯改變。試驗結果對2 種槐花的有效區分和利用提供參考。