基于多種分析模式建立壯藥材火索藤的HPLC 指紋圖譜

劉 笑 ，李林杰 ，王昱涵 ，王志萍

（1.廣西中醫藥大學藥學院/中藥制劑共性技術研發重點實驗室，南寧 530200；2.廣西衛生職業技術學院藥學系，南寧 530023）

火索藤（Bauhinia aureaLevl.），又名牛蹄藤、紅絨毛羊蹄甲、紅毛藤、金葉羊蹄甲、合掌風、九龍藤、黃麻藤，壯藥名“huha”（“愈合”之意），為豆科羊蹄甲屬植物火索藤的根或莖，亦有全株入藥的記載［1，2］。主要產自廣西、貴州、云南等地［3，4］，是廣西壯族自治區（簡稱廣西）特色壯藥材，在廣西壯族民間有一定的使用歷史。其性溫，味微苦、澀，具有祛風除濕，通絡止痛的功效，主治風濕性關節炎、鶴膝風、跌打損傷、腎炎、黃疸型肝炎等癥［4，5］。國內外對火索藤的研究報道較少，主要是化學成分研究［6］，鮮見其質量評價方面的報道。火索藤在民間存在同名異物的情況，不同地區常出現用藥混亂的現象，而該藥又缺乏統一的質量標準，使得各地用藥質量不一，臨床療效差異較大，因此，建立火索藤的質量控制方法十分必要。中藥材指紋圖譜是一種具有高度專屬性的特征圖譜，目前已被廣泛應用于質量控制等方面。建立中藥材指紋圖譜不僅能較全面地反映藥材所含成分的相互關系，而且還可以對不同批次藥材進行準確區分，有效地鑒別藥材的產地和真偽，可以較好地控制藥材的質量，確保藥材質量的穩定。本研究對火索藤進行HPLC 指紋圖譜研究，建立不同產地火索藤甲醇提取物的HPLC 指紋圖譜，并進行相似度評價、聚類分析和主成分分析，以期更好地對其質量進行評價和控制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 火索藤樣品分別采自廣西來賓市、岑溪市、梧州市、玉林市、河池市及南寧市等不同市縣或鄉鎮，其中采自廣西來賓市興賓區天堂鄉的火索藤經廣西中醫藥大學生藥學專家韋松基教授和廣西中醫藥研究所黃云峰副研究員鑒定為豆科植物火索藤的帶葉藤莖，編號HST-1，作為對照藥材，并將其莖、葉、果莢制成臘葉標本。2～10 批按采收日期分別編號HST-2～HST-10。樣品信息見表1。

表1 火索藤樣品信息

1.1.2 試劑 色譜級乙腈、色譜級甲醇、分析純甲醇、磷酸。

1.1.3 試藥 表兒茶素（純度99.82%，批號RP190620）對照品購自成都麥德生科技有限公司；金絲桃苷（純度 98.49%，批號 MUST-20052210）、槲皮苷（純度98.87%，批號MUST-20121401）對照品購自成都曼思特生物科技有限公司。

1.1.4 儀器 SQP 型電子天平，賽多利斯科學儀器北京有限公司；FLBP-200 型萬能高速粉碎機，上海菲力博食品機械有限公司；PL-FS40T 型超聲波清洗機，東莞康士潔超聲波科技有限公司；島津LC-2030C 3D 型高效液相色譜儀（包括PAD 型檢測器、LabSolution 工作站），日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 火索藤HPLC 指紋圖譜方法的構建

1）供試品溶液的制備。取火索藤對照藥材粉末（過2 號篩）1 g，精密稱定，置于帶塞錐形瓶中，精密量取25 mL 甲醇加入，稱重，超聲處理1 h，放涼后甲醇補足失重，搖勻，過濾。取濾液過0.45 μm 微孔濾膜。

2）混合對照品溶液的制備。精密稱取表兒茶素、金絲桃苷、槲皮苷適量，加甲醇制成質量濃度分別為0.048、0.052、0.112 mg/mL 的混合對照品溶液。

3）色譜條件。色譜柱：Inertsil ODS-SP C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸水；梯度洗脫：0～40 min，8%～16%乙腈；40～60 min，16%～18% 乙腈；60～65 min，18%～20% 乙腈；65～85 min，20%～28%乙腈；85～100 min，28%～40%乙腈；流速 1.0 mL/min；柱溫 30 ℃；進樣量10 μL；檢測波長212 nm。

1.2.2 方法學考察

1）精密度試驗。按照“1.2.1”方法制備供試品溶液，按“1.2.1”色譜條件連續重復進樣6 次，測定并記錄。

2）重復性試驗。 取火索藤藥材（批號20190726）6 份，按照“1.2.1”方法制備供試品溶液，按“1.2.1”色譜條件連續進樣測定。

3）穩定性試驗。按照“1.2.1”方法制備供試品溶液，按“1.2.1”色譜條件分別于 0、2、4、8、12、24 h 進樣，測定并記錄。

2 結果與分析

2.1 火索藤HPLC 指紋圖譜的建立

按照“1.2.1”方法，得到火索藤甲醇提取液HPLC 指紋圖譜。將混合對照品色譜圖與火索藤的指紋圖譜進行對比，比較二者的保留時間，可指認火索藤指紋圖譜中的3、9、11 號峰分別為表兒茶素、金絲桃苷、槲皮苷（圖1）。

圖1 混合對照品（A）及火索藤供試品（B）的HPLC

2.2 方法學考察

2.2.1 精密度試驗 以11 號峰（槲皮苷）為參照，計算得到各共有峰相對保留時間的RSD值為0.029%～0.131%，相對峰面積的RSD值為0.176%～0.811%，表明儀器精密度良好。

2.2.2 重復性試驗 以11 號峰（槲皮苷）為參照，計算得到各共有峰相對保留時間的RSD值為0.128%～0.587%，相對峰面積的RSD值為1.653%～2.986%，表明建立的方法重復性好。

2.2.3 穩定性試驗 以11 號峰（槲皮苷）為參照，計算得到各共有峰相對保留時間的RSD值為0.095%～0.348%，相對峰面積的RSD值為0.167%～2.963%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3 10 批火索藤HPLC 指紋圖譜的建立

2.3.1 共有峰的確定 取10 批火索藤樣品，按“1.2.1”方法制備供試品溶液，按“1.2.1”色譜條件進樣測定，將10 批火索藤樣品的色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）”中進行色譜峰處理，采用中位數法，以0.1 min 為時間寬度，S1（HST-1）為參照圖譜，選擇分離度好、含量較大的11個色譜峰作為壯藥火索藤的指紋圖譜共有特征峰，經色譜圖多點校正后自動匹配并生成對照指紋圖譜R，得到10 批火索藤的指紋圖譜（圖2）。

圖2 10 批火索藤HPLC 指紋圖譜

2.3.2 相似度評價 在“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）”中，選擇“計算相似度”，系統則以生成的對照指紋圖譜R 為對照，對10 批火索藤藥材的指紋圖譜進行相似度計算，HST-1～HST-10，相似度分別為0.974、0.939、0.958、0.907、0.986、0.986、0.932、0.938、0.969、0.969。10 批火索藤指紋圖譜的相似度均在0.900 以上，表明廣西不同產地火索藤的化學組成一致性較好。

以11 號峰（槲皮苷）為參照峰，分別計算10 批火索藤指紋圖譜共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值。10 批火索藤11 個共有峰的相對保留時間的RSD值為0.054%～0.349%，說明11 個共有峰的出峰時間較穩定，反映了不同產地不同批次火索藤的化學成分一致性好；相對峰面積的RSD值為36.885%～101.756%，表明不同產地不同批次火索藤的共有成分含量差異較大，猜測與土壤、氣候的差異等因素有關。

2.4 聚類分析

采用SPSS21.0 統計軟件，以11 個共有峰的峰面積數據為變量，以Ward 法作為聚類方法，以平方Euclidean 距離為度量標準，對10 批火索藤指紋圖譜共有峰的峰面積進行聚類分析，結果見圖3。

圖3 10 批火索藤聚類分析

由圖3 可知，歐氏距離為5.5 時，10 批火索藤樣品可分為 4 類，第 1 類：HST-1、HST-5、HST-6；第 2類：HST-2、HST-3、HST-4、HST-9；第 3 類：HST-8；第4 類：HST-7、HST-10。聚為一類的樣品可反映其在共有峰表達上的相似性。

2.5 主成分分析

運用SPSS21.0 統計軟件，以11 個共有峰的峰面積數據為變量（Z 標準化后）進行主成分分析。主成分提取分析結果見表2。

表2 主成分解釋的總方差

按照特征值大于1 的標準，抽取出2 個主成分，分別記作 PC1、PC2。PC1 的特征值為 7.770，PC2 的特征值為1.852，分別能解釋70.634%、16.836%的總體變異度，2 個主成分的累計方差貢獻率達87.470%，即涵蓋了火索藤指紋圖譜中87.470%的化學信息，表明這2 個主成分能夠代表最初的11 個共有峰來分析與藥材質量的相關性。

成分矩陣可以反映各原始因素與不同成分的相關程度。相關系數絕對值越大，說明該原始變量與這個提取因子關系更密切。共有峰主成分矩陣見表3。

表3 共有峰主成分矩陣

由表 3 可知，峰 2～峰 10 在 PC1 上有明顯載荷，歸屬為PC1，因此PC1 主要反映了2～10 號色譜峰的信息，其中3 號峰為表兒茶素、9 號峰為金絲桃苷；而峰 1、峰11 在 PC2 上負荷較多，將其歸屬為 PC2，PC2集中反映1 號、11 號色譜峰的信息。由于PC1 的特征值與方差貢獻最大，因此其變量的權重值在很大程度上可反映化學成分與藥材質量的相關性。比較PC1 中各變量的權重值，大于0.8 的變量對應的峰為2～9 號峰，說明這8 個峰對藥材質量影響較大。

主成分公因子表達式可由主成分系數矩陣計算而得，主成分系數矩陣見表4。主成分公因子表達式如下。

表4 主成分得分系數矩陣

PC1=-0.057×Z 峰 1+0.123×Z 峰 2+0.114×Z 峰 3+0.125×Z 峰 4+0.107×Z 峰 5+0.126×Z 峰 6+0.116×Z 峰7+0.120×Z 峰 8+0.127×Z 峰 9+0.095×Z 峰 10+0.035×Z峰11

PC2=0.451×Z 峰 1+0.102×Z 峰 2+0.164×Z 峰 3+0.080×Z 峰 4-0.169×Z 峰 5-0.015×Z 峰 6-0.153×Z 峰7+0.153×Z 峰 8-0.006×Z 峰 9-0.116×Z 峰 10+0.451×Z峰11

經計算可得到各批次主成分得分，再以2 個主成分所對應的方差貢獻率占所提取主成分累計方差貢獻率的比例為權重系數建立模型，計算各批次的綜合得分（表 5），模型為 Y=70.634×PC1/87.470+16.836×PC2/87.470。

表5 各批次主成分得分及綜合得分

由表5 可知，同一產地的PC1 與PC2 分值排名不一定相同，說明評價不同產地藥材的質量應當結合各項指標進行綜合評價，因此結合2 個主成分因子的綜合評分，按分值高低排序得到10 批火索藤藥材的綜合排名為 HST-7＞HST-10＞HST-8＞HST-1＞HST-6＞HST-3＞HST-5＞HST-9＞HST-2 ＞ HST-4，將同個產地的分值平均后，可得到7 個不同產地火索藤質量的綜合排名為南寧隆安＞來賓興賓＞岑溪安平＞梧州龍圩＞河池東蘭＞玉林北流＞玉林容縣，其中采自南寧隆安的火索藤藥材整體質量最好。

對各批次共有峰面積進行主成分分析后，根據各批次的PC1、PC2 得分，建立以PC1 得分為橫坐標、PC2 得分為縱坐標的空間散點坐標系，得到10 批次火索藤的主成分空間得分（圖4）。

圖4 不同批次火索藤的主成分空間得分

由圖 4 可知，2 個主成分可將 10 批藥材分成 4 個類別，HST-1、HST-5、HST-6 為一類，HST-2、HST-3、HST-4、HST9 為一類，HST-8 聚為一類，HST-7、HST-10 聚為一類，與聚類分析結果一致。

3 小結與討論

為了較全面控制火索藤的內在質量，應選擇與藥材藥效相關的成分作為指標成分。通過查找相關文獻發現，表兒茶素具抗氧化、降脂降糖、預防心血管疾病、抗炎、保護神經、抑菌等作用［7］，金絲桃苷具抗肝損傷、抗炎、抗菌、抗癌、抗血栓、抗氧化應激作用（抗炎、解痙、利尿、局部和中樞鎮痛等）［8-10］，槲皮苷具抗炎鎮痛作用，抗炎活性主要表現為對致炎性因子的抑制［11］，3 種成分均與火索藤的藥效作用相關，故將其作為指紋圖譜的指標性成分。本研究指認了指紋圖譜中的3 種已知成分，表兒茶素（3 號峰）、金絲桃苷（9 號峰）和槲皮苷（11 號峰）。其中槲皮苷的含量較高，峰面積占總峰面積的比例適宜，故將槲皮苷色譜峰（11 號峰）作為參照峰（S）。

本研究建立了火索藤甲醇提取物的HPLC 指紋圖譜，確定了11 個共有峰，指認了其中3 種成分；各批次火索藤的指紋圖譜相似度均大于0.90，說明所建立的指紋圖譜具有良好的穩定性和可控性；通過對不同批次火索藤進行聚類分析、主成分分析，找到對藥材質量影響較大的8 個成分，并對不同批次、不同產地的火索藤進行了綜合評價，可為其質量評價與控制提供依據。