氯化銫處理對菠菜葉片光系統Ⅱ活性的影響

徐 靜，王 超，伍 勇，吳秀麗，馬澤剛

（四川衛生康復職業學院，四川 自貢 643000）

137Cs 作為生物學上最危險的放射性核素之一，在自然界的本底值很低，隨著核工業的發展、核設施的運行以及突發性核事故，尤其是切爾諾貝利核事故和日本福島核事故，導致Cs 在自然界的本底值不斷升高［1］。美國核能研究所（NEI）研究發現，每年有2 000～2 300 t 的核廢物通過各種途徑釋放到環境，大量放射性核素Cs 累積在水體和土壤，極易通過農作物和果蔬進入食物鏈，不但對生態系統造成嚴重污染，還會對動物和人類健康造成極大的潛在威脅［2，3］。因此 Cs 污染的生物效應及其修復技術的研究一直是近年來的關注熱點。以往Cs 污染對植物影響的研究主要集中在植物生長、種子萌發、生物量、抗氧化酶活性以及不同植物對Cs 的富集能力等方面［4-6］，但Cs 對植物光合作用的影響鮮有報道。光合作用是生物界最基本的物質和能量代謝過程之一，且對逆境脅迫非常敏感。筆者及實驗室前期圍繞Cs 脅迫對植物光合作用的影響進行了系列研究，結果表明外源高濃度CsCl 處理會抑制植物葉片的凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間 CO2濃度（Ci）以及蒸騰速率（Tr），與此同時，葉綠素的合成、光合電子傳遞活性也會受到一定抑制，從而對植物光合作用造成顯著影響［7］。

快速葉綠素熒光誘導動力學曲線是指暗適應的植物部分組織突然暴露在可見光下，其熒光隨時間變化的曲線。JIP-測定（JIP-test）是以生物膜能量流動為基礎，針對快速葉綠素熒光誘導動力學曲線建立的數據分析和處理方法，利用該方法可以獲得有關光系統Ⅱ（photosystem Ⅱ complex，PSII）的大量信息，從而了解環境因子影響下植物材料光合機構的動態變化情況［8］。另外，已有研究表明，植物對穩定性銫和放射性銫同位素的吸收及其在體內的積累有相同的特征［9］。因此，試驗在前期研究基礎上，以菠菜（Spinacia oleraceaL.）為試驗材料，用穩定性銫同位素133Cs 代替放射性同位素137Cs，利用快速葉綠素熒光誘導動力學分析，進一步探究不同濃度Cs 處理對植物光合作用的影響機制，以期為揭示Cs 對植物生長發育的影響以及Cs 污染的植物修復技術提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗以藜科植物菠菜作為供試材料，選取長勢一致的健康菠菜幼苗，移栽至8 kg/盆石英砂中（盆高25 cm，直徑33 cm），每盆6 株。分別設置0、1、5、10、20 mmol/L 5 個CsCl 處理濃度。待菠菜幼苗長到5 葉期時，用含不同濃度 CsCl 的 Hoagland（pH 6.0）營養液進行處理，每天補充營養液100 mL，處理15 d后進行相關指標的測定，每個處理5 次重復。

1.2 快速葉綠素熒光誘導動力學曲線測定

參考 Strasser 等［10］的方法，葉片在測定前，先充分暗適應20 min，然后暴露在飽和脈沖光下，用MPEA（Hansatech，英國）測量菠菜葉片快速葉綠素熒光誘導動力學曲線（O-J-I-P 曲線）。

1.3 JIP-test分析

獲得的O-J-I-P 曲線用JIP-test 進行分析，需要用到 20 μs 時熒光（O 相，Fo）、300 μs 時熒光（K 相）、2 ms時熒光（J相）、30 ms時熒光（I相）和最大熒光（P相，FM）。JIP-test分析所用的參數及其定義見表1。

表1 JIP-test分析所用的參數及其定義

2 結果與分析

2.1 CsCl 處理對菠菜快速葉綠素熒光誘導動力學曲線的影響

將不同時間的熒光強度Ft標準化，標準化后的熒光強度用Vt表示，以Vt繪制O-J-I-P 標準曲線（圖1-A-1、1-B-1、1-C-1）。受 CsCl 不同處理濃度及不同處理時間的影響，菠菜葉片均呈現典型的葉綠素快速熒光動力學曲線，形狀相似且到達P 點的時間差異不明顯。為了較為清晰地比較不同環境差異對菠菜葉片熒光信號強度的差異，以0 處理為對照，用其他與對照組標準化熒光差值（ΔVt）重新作圖（圖1-A-2、1-B-2、1-C-2）。結果表明，CsCl 處理后，菠菜葉片的J 點發生變化，1～5 mmol/L CsCl 處理菠菜幼苗 6、9 d 后，J 點降低，但當處理濃度達到 10～20 mmol/L 時，J 點顯著升高，同樣，CsCl 處理 12 d 后，J點均高于對照。

圖1 不同濃度CsCl處理菠菜葉片快速葉綠素熒光動力學曲線

2.2 CsCl 處理對菠菜PSII 電子供/受體側性能的影響

圖2 顯示不同濃度CsCl 處理菠菜后，菠菜葉片J相相對可變熒光（Vj）、I 相相對可變熒光（Vi）、可變熒光Fk占FJ-Fo振幅的比例（Wk）、熒光誘導曲線的初始斜率（Mo）、標準化后的J-P 相和直線F=FM之間的面積（Sm）和從 2 ms 到tFm時間段內 QA氧化還原次數（N）的變化情況，從而推測CsCl 處理對菠菜葉片PSII 電子供/受體側性能的影響。隨CsCl 處理濃度和處理時間的增加，Vj和Wk值呈先上升后下降的趨勢，Vi明顯下降。其中，Vj在處理濃度為1 mmol/L，處理6 d 時達最高值；Wk在處理濃度為10 mmol/L、處理時間12 d 時達最高值，較同期對照增加了33.94%。Mo值隨CsCl 處理濃度和處理時間的增加，呈現先略微下降后上升趨勢，當CsCl 處理濃度為0～5 mmol/L時，Mo值變化不顯著，但當處理時間較長，CsCl 處理抑制了從QA-往下的電子傳遞，此時QA被還原得最快，Mo值逐漸升高，并在20 mmol/L 達到最高。Sm在處理 6、9 d 后變化不顯著，但處理 12 d 后，Sm值均高于對照，且與同期對照相比，Sm分別升高了7.1%、24%、9.2%、17.8%。N值變化均不顯著。

圖2 不同濃度 CsCl處理對菠菜葉片 Vj、Vi、Wk、Mo、Sm和 N 的影響

2.3 CsCl處理對菠菜反應中心的影響

圖3 表示不同濃度CsCl 處理菠菜葉片后，單位反應中心光合機構比活性參數單位反應中心吸收的能量（ABS/RC）、單位反應中心熱耗散掉的能量（DIo/RC）、單位反應中心捕獲的能量（TRo/RC）、單位反應中心用于電子傳遞的能量（ETo/RC）的相對變化值。當CsCl 處理濃度較低時（1～5 mmol/L），ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC、ETo/RC值略有升高，隨 CsCl 處理時間的延長以及處理濃度的增加，尤其是在較高濃度（10～20 mmol/L）處理下，PSII 反應中心不斷降解和失活，且在20 mmol/L處理12 d時達最大值，ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC、ETo/RC分別較對照組增加了39.73%、22.01%、26.64%、24.19%。

圖3 不同濃度CsCl處理對菠菜幼苗ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC、ETo/RC 的影響

2.4 CsCl 處理對菠菜PSII 量子產量及光合性能參數的影響

如圖 4 所示，CsCl 脅迫后，菠菜葉片 PSII 最大量子效率（φPo）呈先略微上升后下降趨勢，且在1 mmol/L處理時達最高值，分別較對照組增加了1.67%（6 d）、1.56%（9 d）、1.07%（12 d），在 20 mmoml/L 處理時達最低值，分別較對照降低了3.63%（6 d）、3.62%（9 d）、3.77%（12 d）。φEo代表吸收的光量子將電子傳遞到電子傳遞鏈中QA-下游的其他電子受體的概率、Ψo代表捕獲的激子將電子傳遞到電子傳遞鏈中QA-下游的其他電子受體的概率也呈現類似趨勢，低濃度脅迫并未引起菠菜葉片φEo、Ψo的顯著變化，但在10～20 mmol/L 處理濃度下φEo、Ψo顯著降低。以吸收光能為基礎的性能指數（PIABS）隨CsCl處理濃度及處理時間的升高，其值顯著下降，并在20 mmol/L 處理12 d時達最低值，較同期對照降低了33.11%。

圖4 不同濃度CsCl處理對菠菜幼苗φPo、φEo、Ψo和PIABS的影響

3 小結與討論

當植物遭受外界環境脅迫時，不能像動物一樣移動到更適宜的環境中去，因此，植物為了生存，必須能夠迅速識別外界刺激，并產生和傳遞信號，通過激發自身的防御機制來應對脅迫［11］。光合作用是植物將光能轉化為化學能的過程，是植物對逆境最為敏感的生理過程之一。在光合機構捕獲光能發生電子傳遞的同時，還有一部分能量以熱和熒光的形式耗散，如果電子傳遞過程受到阻礙，熒光和熱耗散便會上升。快速葉綠素熒光誘導動力學可以利用植物在逆境脅迫下發出的豐富的熒光信號，來間接監控植物葉片PSII 受損程度、受損部位及光合電子傳遞情況，為深入研究逆境脅迫對光合作用原初反應的影響提供了有力而便捷的工具［10］。

典型的快速葉綠素熒光誘導動力學曲線有OJ-I-P 等相，曲線特征位點的變化較為直觀地表明PSII反應中心原初光化學反應的變化，其中J相反映QA-瞬間最大積累量，研究表明，J 相上升代表PSII 受體側QA到QB間的電子傳遞受阻［12］。本試驗結果顯示，不同濃度 CsCl 處理菠菜葉片 6、9、12 d 后，J 相發生變化。1～5 mmol/L CsCl 處理菠菜葉片 6、9 d 后，J相略微降低，推測此時PSII 受體側沒有受到過多傷害，機體可以通過調節QA到QB間的電子傳遞能力來適應環境變化，但當CsCl 處理濃度增加或處理時間延長后，J 相顯著上升，說明此時CsCl 處理可能抑制了QA到QB間的電子傳遞過程，PSII受體側受到損傷。

在光合機構中，天線色素吸收的光能被轉化為激發能，再傳遞到兩個光系統的反應中心，進而推動原初光化學反應，被激發的電子被移交給原初電子受體QA，生成QA-。2 ms 時熒光（J 相）、30 ms 時熒光（I 相）分別顯示了2 ms 和30 ms 時QA-的第一次瞬時最大積累，因此Vj和Vi可以反映葉片中QA和QA-的比例。研究表明，外界脅迫會在一定程度上導致QA/QA-的氧化還原勢上調。本試驗結果顯示，不同CsCl處理濃度下，Vj隨濃度的增加，呈現先上升后下降的趨勢，Vi呈明顯下降趨勢，說明較高CsCl處理濃度下會導致QA/QA-的氧化還原勢上調。Wk代表可變熒光Fk占Fj-Fo振幅的比例，Wk數值的大小會受到PSII 供體側和受體側傷害程度的共同影響［13］。Strasser等［14］認為K 點是由于 PSII 供體側放氧復合體（OEC）流向PSII反應中心的電子與PSII反應中心流向受體側的電子的不平衡造成的。若單純是OEC 受傷，次級電子供體酪氨酸殘基的電子仍能流向PSII反應中心，進而流向受體側，此時Wk值升高，但當PSII 供體側和受體側同時受到傷害，會使得PSII 供體側流向PSII 反應中心的電子減少，與此同時，PSII 反應中心流向受體側的電子也減少，因此，Wk值的大小可以反映OEC 相對于受體側的限制程度，Wk值越大，表明供體側限制越大。本試驗結果表明，經CsCl 脅迫，隨處理濃度和處理時間的增加，菠菜葉片的Wk呈現先上升后下降趨勢，但總體高于對照。推測較短時間內較低濃度CsCl 處理會導致菠菜PSII 供體側OEC 受到一定損傷，且傷害程度大于受體側，但隨處理濃度和處理時間的增加，PSII 受體側受到損傷，這與快速葉綠素熒光動力學曲線中J 相在較高濃度處理下顯著上升的結論一致。Mo代表QA被還原的相對速率，菠菜葉片經CsCl 脅迫后，Mo同樣呈現先上升后下降的趨勢，當處理時間較長，CsCl 處理抑制了從QA-往下的電子傳遞，此時QA被還原得最快，Mo值最高。Sm代表標準化后的J-P 相和直線F=FM之間的面積，它反映了從2 ms 到tFm時間內QA下游的電子受體庫的大小，也就是關閉所有反應中心需要的能量。N代表從2 ms 到tFm時間內QA的氧化還原次數。從QA-傳遞走的電子比例越高，Sm的值就越大。本次試驗結果表明，隨CsCl 處理時間的延長，Sm值逐漸升高，此時，菠菜葉片從QA-傳遞走的電子較多，PSII受體側的電子傳遞能力增強。

當機體受到外界脅迫時，部分反應中心失活，失活的反應中心天線捕獲的光能被傳遞到有活性的反應中心上，因此有活性的反應中心比活性會升高。本研究中，當 CsCl 處理濃度較低時（1～5 mmol/L），ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC、ETo/RC參數值略有升高，隨CsCl 處理時間的延長以及處理濃度的增加，PSII 反應中心不斷降解和失活，剩余的有活性的反應中心的比活性參數大幅度升高，說明外界脅迫導致菠菜葉片PSII 反應中心遭到不同程度損傷，反應中心部分失活，從而增加剩余反應中心的激發壓。

φPo、φEo、Ψo隨著 CsCl 處理濃度的增加，呈現先上升后下降趨勢。結果表明，低濃度脅迫下，菠菜通過調節受體側QA傳遞電子的能力，即有活性的反應中心的開放程度升高，促使PSII光合活性增大，從而適應外界環境的變化，但當處理濃度增加，φPo、φEo、Ψo下降，說明此時光和機構被逐漸破壞。PIABS是JIP-test 的參數中對環境變化最為敏感的參數之一，它可以反映植物利用光能的綜合性能，常作為了解整個原初光化學反應對外界環境變化的響應依據［15］。本研究中，PIABS顯著下降，也說明 CsCl 脅迫導致菠菜葉片原初光化學反應受到一定傷害，從而影響光合作用。

綜上所述，利用快速葉綠素熒光動力學參數分析，可以直觀表現CsCl 脅迫對菠菜光合作用原初反應的影響。CsCl脅迫下，菠菜葉片的OJIP 曲線、PSII供/受體側性能參數、反應中心、PSII 量子產量等均受到一定影響，且高濃度處理影響較為明顯。1～5 mmol/L 較低CsCl 濃度處理雖然抑制了菠菜PSII 反應中心供體側到反應中心的電子傳遞過程，但影響不顯著，可能是菠菜通過調節光合機構對光能的捕獲和轉化效率來緩解傷害，從而來適應環境變化，這也是植物應對外界環境脅迫的一種自我保護機制，但高濃度CsCl 處理則會導致菠菜葉片PSII 受體側同樣受到傷害、QA/QA-的氧化還原勢上調以及反應中心部分失活。