泡桐毛白33 號對鎘的吸收及其亞細胞分布研究

朱秀紅，李哲靜，張記鐘，張 萌，王明昆，茹廣欣

（河南農業大學林學院，鄭州 450002）

近年來，隨著全球工業化的高速發展，工業“三廢”排放量越來越大，重金屬污染問題日益嚴重，其中鎘污染物點位超標率高達7.0%［1］，位居重金屬污染物含量排行榜第一。鎘毒性高、遷移性強且難降解，易被動植物和微生物吸收、轉移和富集，再通過食物鏈轉移到人體，嚴重損害人類健康［2］。植物修復具有成本低、二次污染易于控制、植被形成后具有保護表土、減少侵蝕和水土流失的功效等優點，成為當前研究的重點和熱點［3］。

鎘脅迫會誘導植物細胞產生大量的活性氧（ROS），打破氧化還原反應穩態平衡，導致細胞結構受到功能性損傷，從而影響植物生長代謝。為維持胞內Redox 平衡，植物體通過調節抗氧化酶系統、增加滲透調節物質及非蛋白巰基化合物含量、細胞壁固持和液泡區室化效應［4，5］等方法提高植物耐 Cd 能力。泡桐（Paulownia fortunei）具有速生、豐產、生物量大、經濟價值高、材質優良、繁殖容易、栽培歷史悠久、經濟價值高等眾多優點，但是國內對泡桐的研究集中在遺傳選育與繁殖技術［6］、栽培與造林技術［7］、病蟲害防治［8］、黃酮類化合物提取［9］、生物質燃料制備［10］等方面，有關泡桐在重金屬脅迫下的生長生理狀況鮮見報道。為此，本研究通過測定Cd 脅迫下泡桐毛白 33 號（Paulownia tomentosa×P.fortunei33）幼苗的［6］生理生化等特性，從植株和細胞兩個層次上探究泡桐毛白33 號對Cd 的吸收規律及耐Cd 原因，以期為該植物在重金屬污染修復方面的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020 年10 月下旬在河南農業大學林木遺傳育種實驗室進行。泡桐毛白33 號種子經H2O2消毒后，用去離子水浸種24 h 催芽，后置于發芽盒中待其萌發，等其長至兩葉一心后向發芽盒中加入1/5 Hongland 營養液促進其生長，2～3 d 更換一次營養液，培養一周后將幼苗置于1/2 Hongland 營養液繼續培養，2～3 d 后移至Hongland 完全營養液中培養，每3 d 更換一次營養液。

1.2 試驗設計

全營養液中培養30 d 后，選擇長勢一致茁壯的幼苗隨機分組，采用CdCl2為Cd 源加入營養液中對幼苗進行Cd 脅迫處理。試驗設置5 個處理，Cd 濃度分別為：0（CK）、10 mg/L（T1）、20 mg/L（T2）、30 mg/L（T3）和40 mg/L（T4），各處理3 次重復，每個重復10株幼苗。連續Cd 脅迫15 d 后，收取樣品。

1.3 測試指標與方法

泡桐毛白33 號各部位Cd 含量用原子吸收分光光度計（AASZEEnit700）測定；根系參數利用Epson根系掃描儀掃描，WinRhizo 軟件分析；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定，脯氨酸（Pro）含量采用酸性茚三酮法測定［11］；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑（NBT）法測定［12］；過氧化物酶（POD）活性采用愈創木酚法測定［13］；過氧化氫酶（CAT）活性采用雙氧水法測定［14］；谷胱甘肽（GSH）含量測定參照Monostori 法，非蛋白巰基（NPT）含量測定參照Keltjens 法［15］，螯合肽（PCs）含量=NPT 總量－GSH 含量；亞細胞組分的提取參照Xin 等［16］的方法。

1.4 數據分析

試驗數據使用Excel 2016 和SPSS 20.0 軟件進行統計分析，采用單因素ANOVA 完成處理，利用Duncan 法進行多重比較（α=0.05），Excel 2016 制圖。

2 結果與分析

2.1 Cd 脅迫下泡桐毛白33 號各部位Cd 含量

由表1 可知，不同濃度鎘處理下，Cd 含量均表現為根＞葉＞莖，且均隨Cd 脅迫濃度的升高而顯著增大。隨Cd 脅迫濃度的升高，轉運系數及葉片富集系數呈降低趨勢，根部及莖部生物富集系數呈先顯著降低后顯著升高趨勢。

表1 不同濃度鎘處理下泡桐毛白33 號各部位的Cd 含量、生物富集系數及轉移系數

2.2 Cd脅迫下泡桐毛白33號根系形態及耐性指數

低濃度（10 mg/L）鎘處理下，每處理組平均根長、平均根表面積、平均根體積分別比對照增大3.53%、31.89%、25.00%（表2）。隨著鎘濃度的增大，以上各指標相比對照均減小，40 mg/L 時達到最小值，分別為對照的68.16%、72.45%、66.67%，平均根尖數、平均根尖分叉數及耐性指數均減小。

表2 不同濃度鎘處理對泡桐毛白33 號根系形態及耐性指數的影響

T4 植株根部呈黑褐色，并伴有壞死現象，可見泡桐毛白33 號可承受低濃度Cd 脅迫，高濃度Cd 脅迫會抑制幼苗根系的正常生長發育。

2.3 Cd 脅迫 對泡桐 毛白 33 號 MDA 含 量及 Pro 含量的影響

MDA 含量可反映植物細胞膜脂過氧化程度，Pro 可清除活性氧自由基，維持細胞膜穩定，二者是衡量植物逆境生長的重要指標［17］。由圖1 可知，泡桐毛白33 號幼苗體內MDA 含量與Pro 含量整體與鎘濃度呈正相關。鎘濃度低于20 mg/L 時，葉片MDA 含量相比CK 先小幅上升，后下降至與CK 持平，根部MDA 含量相比CK 變化不顯著。鎘濃度為20 mg/L 時，根部和葉部中Pro 含量分別為對照的2.33、1.41 倍；當鎘濃度提高到 40 mg/L 時，根部和葉部中MDA 含量和Pro 含量分別為對照的1.43、1.30倍和6.67、3.12 倍。試驗結果表明，高濃度鎘脅迫會顯著加重泡桐幼苗細胞膜脂過氧化程度，但同時，脯氨酸含量的升高可清除過量ROS，維持細胞內滲透壓及質膜的完整性，增強植株抗逆能力。

圖1 鎘脅迫處理對泡桐毛白33 號MDA 含量和Pro 含量的影響

2.4 Cd脅迫對泡桐毛白33號抗氧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶（SOD）屬防御性酶，可清除活性氧。由圖2A 可知，鎘脅迫處理下，泡桐葉片SOD活性相比對照變幅較平穩，活性基本穩定。根部SOD 活性先降低后升高，當Cd 處理濃度為10 mg/L時，根部SOD 活性比對照降低16.71%；但是當Cd 濃度升高為40 mg/L 時，根部SOD 活性又高于對照。且總體來看，泡桐幼苗根部SOD 活性顯著高于葉片。

過氧化物酶（POD）是防止膜脂過氧化的關鍵酶。由圖2B 可知，相比對照，泡桐幼苗根部和葉片POD 活性與鎘濃度呈正相關。當鎘濃度為40 mg/L時，根部和葉部中POD 活性分別為對照的1.71、2.50倍。且總體上泡桐幼苗根部POD 活性顯著高于葉片。

過氧化氫酶（CAT）與SOD、POD 具有協同作用，可清除植物通過呼吸作用和光合作用等活動產生的過氧化物。由圖2C 可知，泡桐葉部CAT 活性隨著Cd 濃度的升高先升高后下降，20 mg/L 鎘處理下，其活性達最高值，為對照的1.52 倍，鎘濃度升高為40 mg/L 時，其活性相比對照組變化不顯著；根部CAT活性變化與鎘濃度呈正相關，當鎘濃度為40 mg/L時，根部CAT 活性為對照的2.33 倍?？傮w來看，泡桐幼苗葉片CAT 活性顯著高于根部。

圖2 鎘脅迫處理對泡桐毛白33 號抗氧化酶活性的影響

2.5 Cd 脅迫對泡桐毛白 33 號 NPT、GSH、PCs 含量的影響

由圖3A 可知，隨著鎘濃度的增大，泡桐毛白33號幼苗各部位NPT 含量均呈先上升后下降趨勢，且葉部變化趨勢顯著大于根部。當鎘處理濃度為20 mg/L 時，根和葉中NPT 含量均達峰值，分別為1.61、2.54 μmol/g FW，分別為對照的 1.44 倍和 1.57倍；鎘處理濃度高于20 mg/L 時，各部位NPT 含量開始下降，但仍高于對照組。當鎘處理濃度為40 mg/L時，根部和葉中NPT 含量達1.31、1.71 μmol/g FW，分別為對照的1.17 倍和1.06 倍。

由圖3B 可知，隨著鎘濃度的增大，泡桐幼苗各部位GSH 含量呈下降趨勢，不同于NPT 的是，根部GSH 含量高于葉部。與對照相比，鎘處理濃度分別為 10、40 mg/L 時，泡桐根部 GSH 含量下降 14.08%、47.18%，葉部含量下降8.26%、52.01%，根和莖葉的平均降幅分別為32.14%和27.16%。

由圖3C 可知，隨著鎘濃度的增大，泡桐幼苗各部位PCs 含量變化趨勢與NPT 相似，先上升后下降。當鎘處理濃度為20 mg/L 時，葉部PCs 含量達峰值1.71 μmol/g FW，為對照的 4.17 倍；當鎘處理濃度為30 mg/L 時，根部 PCs 含量達峰值 0.62 μmol/g FW，為對照的4.13 倍，且葉中PCs含量顯著高于根部。

圖3 鎘對泡桐毛白33 號NPT、GSH、PCs含量的影響

2.6 Cd脅迫下泡桐毛白33號亞細胞中Cd分布狀況

由圖4A 可知，泡桐幼苗莖葉中鎘主要分布在F1（細胞壁）和F3（可溶組分）中，二者分別占總量的50.61%～75.89%和12.74%～30.80%，在F2（細胞器）中占比較少，僅占11.37%～18.60%。隨著鎘脅迫濃度增大，在莖葉F1 中占比明顯增加，F3 中的占比降低，F2 中變化較小。

由圖4B 可知，泡桐根部鎘分布不同于莖葉部，升高的鎘可被F3（可溶組分）吸收，其次為F1（細胞壁），二者之和占鎘總量的89.94%～92.06%，F2（細胞器）中占比較少，僅占7.91%～10.06%。隨著鎘脅迫濃度的升高，鎘在泡桐根部F1 和F3 中的占比變化與莖葉部相同，F1 中占比從30.23%升高到64.17%，F3 中占比從61.78%下降到32.91%，F2 中變化不明顯。

圖4 泡桐毛白33 號各部位亞細胞組分Cd 所占比例

3 小結與討論

泡桐毛白33 號各部位鎘含量為根＞葉＞莖，隨著鎘濃度的升高，幼苗轉運系數及葉片富集系數呈降低趨勢，根部及莖部生物富集系數呈先顯著降低后略微升高趨勢，各處理下泡桐根部富集系數顯著大于莖部及葉片。說明泡桐毛白33 號根部對鎘的滯留及富集作用強于莖葉，從而減少鎘對地上部位的傷害，此結果與周振等［18］研究結果相符。

植物通過根系直接吸收礦質營養及水分，因此植物遭受Cd 脅迫時，其根系最先受到影響［19］。Lux等［20］發現，鎘脅迫首先抑制根系長度，這可能是因為細胞骨架微管的解聚及染色體的畸變，導致分生細胞有絲分裂活性的降低。本試驗結果表明，低濃度Cd 脅迫促進幼苗根系根微毛的產生，增強了植株獲取養分和水分的能力，高濃度Cd 脅迫破壞了植物根系細胞正常結構，阻礙根尖細胞正常分裂，表皮細胞的崩脫會導致未成熟細胞的死亡，植物吸收營養和水分的能力下降，生長代謝受到抑制，這與前人研究結果一致［21，22］。

MDA 含量可直接反映植物細胞膜脂過氧化程度，脯氨酸可清除活性氧自由基、維持細胞膜穩定、儲存能量等，以滿足植株正常生長代謝，間接反映細胞損傷程度［23］。本試驗中，泡桐根部和葉部MDA 含量及Pro 含量均與Cd 脅迫濃度呈正相關，但當鎘濃度大于10 mg/L 時，Pro 含量才顯著高于對照，鎘濃度大于20 mg/L 時，MDA 含量才顯著高于對照。說明泡桐幼苗可抵抗低濃度鎘脅迫，高濃度鎘脅迫使幼苗體內活性氧大量累積，導致膜脂過氧化程度加重，脯氨酸聯合其他抗氧化酶清除過量ROS，維持細胞內滲透壓及質膜的完整性，增強植株抗逆能力。

植物體的抗氧化酶系統分為酶促系統和非酶促系統，二者協同作用可及時有效地抵御多種理化因子脅迫、清除細胞內活性氧、維護細胞膜結構完整性［24］。本試驗中，幼苗根部SOD 活性隨著鎘濃度的升高先下降后升高，根部POD 和CAT 活性隨著鎘脅迫濃度的升高而升高，且在鎘濃度大于10 mg/L 時顯著升高，這可能是因為，泡桐根部需要緩沖時間去適應鎘脅迫環境，導致根系SOD 活性降低，隨著鎘脅迫濃度的升高，3 種酶產生協同作用來降低重金屬鎘對泡桐根部細胞造成的傷害。泡桐幼苗葉片SOD活性無顯著變化，CAT 活性先升高后降低，POD 活性總體呈上升趨勢，這可能是因為泡桐葉片可抵御低濃度鎘脅迫，在葉片遭遇高濃度鎘脅迫時，POD 和CAT 產生協同作用，聯合清除ROS 等物質。

植物在抵御鎘脅迫時，其體內產生的巰基化合物會緩解植物受毒害程度［25］。本試驗中，泡桐各部位NPT 和PCs 含量先升高后降低，GSH 降低的同時PCs 顯著增加，說明低濃度鎘脅迫可誘導合成NPT和PCs，植物通過消耗較多的GSH 合成PCs 用于抵抗鎘脅迫，且葉部NPT 和PCs 含量明顯高于根部，說明鎘促進泡桐地上部分非蛋白巰基化合物的合成，使-SH 基團免受金屬毒性而不被氧化。隨著鎘濃度的升高，三者含量顯著降低，這是由于高濃度Cd 加劇了植物細胞過氧化損傷，植物體內ROS 產生和清除動態失衡，從而誘導合成NPT 和PCs 及GSH 的能力下降，最終表現為抑制生長。這與Mahdavian等［26］研究結果一致。

泡桐幼苗各部位Cd 主要貯存在細胞壁中，其次是可溶組分，二者之和在莖葉占比為81.41%～88.63%，根部位占比為89.94%～92.06%，這是因為泡桐細胞壁中多糖、蛋白質和木質素等物質對重金屬離子的吸附固持，減少了金屬離子的跨質膜運輸，降低原生質體中的金屬離子濃度，提高植株抗逆能力［27］。當細胞壁對Cd2＋吸收達飽和狀態，Cd 將進入可溶組分?？扇芙M分中檸檬酸、植物絡合素、金屬硫蛋白、硝酸和蘋果酸等物質與游離Cd2＋相結合，形成一種活性很弱的螯合態，從而避免造成細胞器損傷，甚至功能性喪失［28］，此為液胞區室化效應。前述可知，鎘主要積累在泡桐根部，而根部細胞壁和細胞液又是保留鎘的主要組分，降低了鎘向泡桐地上部分的轉運，減少了對植株的傷害。因此，泡桐毛白33 號的耐Cd 機制是植物通過細胞壁固持和細胞液區室化實現對Cd 的固定、絡合、再分配達到緩解Cd脅迫對細胞產生的毒害，從而增強泡桐毛白33 號對重金屬Cd 的耐性和富集能力。這與水稻［29］、龍葵［30］的耐Cd 機理相似。

綜上所述，鎘脅迫下，泡桐毛白33 號各部位Cd2+含量、根長、根體積、根表面積先增大后減小，呈現出“低促高抑”的現象，體現了植物在逆境中自我保護的能力；泡桐根為富集鎘的主要場所，大大降低了鎘對地上部的傷害；鎘脅迫損害了泡桐幼苗根部和葉片細胞膜結構，其自身通過增強抗氧化酶活性來緩解細胞膜受傷害程度，Pro 的積累維持了細胞滲透壓平衡，細胞壁固持和液泡區隔化作用及非蛋白巰基類化合物對鎘的螯合是泡桐重要的耐鎘原因。