自然罹病死亡云斑白條天牛幼蟲體內微生物的分離鑒定

李貝娜，楊振德，林葉邦，徐 蕾，韋善方，班忠華

（1.廣西大學林學院，南寧 530004；2.欽州市林業科學研究所，廣西 欽州 535000；3.巴馬瑤族自治縣核桃產業發展中心，廣西 巴馬 547500）

云斑白條天牛（Batocera lineolata）隸屬于鞘翅目（Coleoptera）天牛科（Cerambycidae），是一種多寄主的重大林業蛀干害蟲，能危害40 余種樹木［1］，尤其是對蠟樹、楊樹和桉樹等可以造成嚴重危害［2］。云斑白條天牛的生活史較為復雜，成蟲和幼蟲均可對寄主造成危害，嚴重影響了林木的經濟、生態和社會效益［3］。在2019 年國家林業和草原局發布的全國林業有害生物普查情況公告中，云斑白條天牛被評定為三級危害性林業有害生物，在中國的危害面積超過 6.7 萬 hm2［4］。

針對云斑白條天牛的防治多采用化學防治以及物理防治的措施［5］，而物理防治要消耗大量的人力物力，化學防治更是造成嚴重的“3R”問題。2013 年7 月8 日，國家林業和草原局將“以生物防治為主的綜合治理”作為國家今后長期要堅持和實施的森林病蟲害防治戰略和策略，標志著中國森林病蟲害防治邁進了生物防治大發展的新時代［6］。微生物殺蟲劑具有許多化學藥劑無可比擬的優點，如特異性強，不傷害天敵，對人畜無害；作用機理復雜，害蟲不易對其產生抗藥性；毒性小低殘留，不破壞生態環境等。目前，針對云斑白條天牛的生物防治主要集中在花絨寄甲、硬皮腫腿蜂、管氏腫腿蜂和白僵菌孢子粉等的應用上［7］。本研究利用傳統微生物分離鑒定與分子生物學鑒定相結合的方法，對若干自然罹病死亡的云斑白條天牛體內細菌和真菌進行分離和鑒定，旨在篩選出云斑白條天牛的致病菌，為進一步研制出以云斑白條天牛致病菌為主要成分的高效復合生物防治制劑提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

2020 年6 月至7 月，在廣西河池市巴馬縣核桃種植基地進行了調查和采樣。選擇危害嚴重的林分、死樹伐木積木場及木材加工廠，進行剝皮或剖木檢查，收集到自然罹病死亡的云斑白條天牛幼蟲共9 頭。

1.2 方法

1.2.1 自然罹病死亡的云斑白條天牛幼蟲體內細菌、真菌的分離 將采集到的9 頭自然罹病死亡的云斑白條天牛幼蟲在超凈工作臺上用無菌去離子水清洗凈表面雜質后置于75%的乙醇中浸泡1 min，取出，用無菌去離子水清洗5～6 次后再用無菌濾紙吸干表面水分，置于無菌解剖盤中用昆蟲針固定，剪開體壁。每個樣品取各部位的組織3 mm3于無菌研磨器中，混勻、研磨并加入10.0 mL 無菌生理鹽水，充分研磨制成組織勻漿液。將勻漿液迅速以10 倍梯度稀釋，各稀釋梯度取0.1 mL 菌液分別滴加于LB 和PDA 培養基平板上，用無菌涂布棒均勻涂布，每個稀釋度重復6 次。將LB 和PDA 培養基平板倒置，分別置于35 ℃和28 ℃的恒溫培養箱內培養，每隔24 h觀察其生長狀況。用接種環挑取顏色、形態、大小各不相同的菌落，轉至新的平板上進行數次4 區劃線分離，直至得到純的單克隆菌株。

1.2.2 罹病死亡的云斑白條天牛幼蟲體內細菌、真菌的鑒定 參照《常見細菌系統鑒定手冊》［8］和《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第八版）［9］，根據菌落形態特征、革蘭氏染色、生理生化特征對分離純化的細菌菌株進行初步鑒定，使用16S rDNA 基因測序進行分子鑒定。采用斜面插片法對分離純化的真菌菌株進行顯微形態特征觀察，根據菌絲生長特征、產孢結構類型、孢子形狀等，參照《真菌鑒定手冊》［10］和《中國真菌志》［11］中的檢索表對真菌菌株進行初步鑒定；使用ITS 通用引物進行雙向測序對真菌進行分子鑒定。

將所測得的基因序列在NCBI 數據庫中進行BLAST 同源性比對，下載同源性較高、已知分類地位菌種（株）的基因序列，使用MEGA 7.0 中的鄰位相連Neighborjoining（NJ）法構建系統發育進化樹，各分支的Bootstrap 置信度用1 000 次自導復制評價。

2 結果與分析

2.1 自然罹病死亡的云斑白條天牛幼蟲體內細菌的分離和鑒定

2.1.1 菌體形態和培養性狀特征 從自然罹病死亡的云斑白條天牛幼蟲體內分離獲得細菌21 株，各菌株形態特征及培養性狀見表1。其中，4 株呈革蘭氏陽性反應，17 株呈革蘭氏陰性反應；1 株為球狀，4 株為短桿狀或球狀，16 株為桿狀；2 株極生鞭毛，5 株無鞭毛，14 株周生鞭毛。

2.1.2 生理生化特性 對21 株菌株進行不同的碳素化合物、氮素化合物和酶的生理生化特性鑒定，結果見表2。除B18 菌株外，其余菌株均能產生過氧化氫酶；除 B15、B16、B18 和B21 號菌株外，其余菌株均能還原硝酸鹽；除 B10、B16 和 B21 號菌株外，其余菌株均能利用檸檬酸鹽；除 B13、B14、B15 和 B17 菌株外，其余均屬于糖發酵型。

表2 自然罹病死亡云斑白條天牛幼蟲體內細菌的生理生化特性

2.1.3 菌株16S rDNA 基因序列分析 將測序結果在NCBI 上進行序列比對，結合RDP 數據庫Classifier 分析，結果見表3。從自然罹病死亡云斑白條天牛幼蟲體內分離出的21 株細菌分屬于變形菌（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes），共涉及 12 個屬，其中克雷伯氏菌屬（Klebsiella）4 株，產堿桿菌屬（Alcaligenes）和芽孢桿菌屬（Bacillus）各3 株，沙雷氏菌屬（Serratia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）各2 株，克呂沃爾氏菌屬（Kluyvera）、腸桿菌屬（Enterobacter）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、變形桿菌屬（Proteus）、普羅威登斯菌屬（Providencia）、拉烏爾菌屬（Raoultella）及漫游菌屬（Vagococcus）各 1 株。16S rDNA 序列鑒定結果與綜合細菌培養性狀、菌體形態、染色反應和生理生化特性等各項指標的鑒定結果基本一致。

表3 自然罹病死亡云斑白條天牛幼蟲體內細菌的16S rDNA 序列比對結果

2.1.4 系統發育進化分析結果 對測序得到的21株細菌的16S rDNA 序列進行系統發育進化分析，可歸類于12 個屬，分別在進化樹上形成獨立的分支，結果如圖1 所示。其中克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、產堿桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬、變形桿菌屬、普羅威登斯菌屬、檸檬酸桿菌屬、克呂沃爾氏菌屬、拉烏爾菌屬形成一個以變形菌門為家族的大分支，除菌株B15、B16、B17 屬于β-變形菌綱（β-proteobacteria）的伯克氏菌目的產堿桿菌科外，其余均屬于γ-變形菌綱（γ-proteobacteria），其中菌株B1～B12 屬于γ-變形菌的腸桿菌科（Enterobacteriaceae），菌株B13、B14 屬于γ-變形菌綱的假單胞科（Pseudomonadaceae）。漫游菌屬和芽孢桿菌屬則形成一個以厚壁菌門的芽孢桿菌綱（Bacilli）為家族的分支，其中菌株B18 屬于乳桿菌目（Lactobacillales）的腸球菌科（Enterococcaceae），菌株 B19、B20、B21 屬于芽孢桿菌目（Bacillales）的芽孢桿菌科（Bacillaceae）。系統發育進化分析進一步支持了RDP Classiffier 分類結果。

圖1 基于16S rDNA 序列的自然罹病死亡云斑白條天牛幼蟲體內細菌系統發育進化樹

2.2 自然罹病死亡的云斑白條天牛幼蟲體內真菌的分離和鑒定

2.2.1 菌落培養性狀特征 從自然罹病死亡的云斑白條天牛幼蟲體內分離純化獲得8 株真菌，各菌株的菌落培養性狀特征見圖2 和表4。所有菌株均不產生水溶性色素，培養基不變色。

表4 真菌菌落培養性狀特征對比

圖2 8 株真菌菌落培養性狀特征

2.2.2 顯微鏡形態特征 各菌株的顯微形態特征如圖3。除菌株F8 菌絲較粗且無隔膜外，其余菌株菌絲均較細且有隔。所有菌株均無假根。僅菌株F2、F3、F6、F7 有足細胞。菌株 F1 孢子呈卵形或橢圓形，其產孢方式為體生式產孢，菌絲上若干產孢細胞組成輪生體，產孢細胞分割或縊縮而形成成串的孢子。菌株F2 和F3 的顯微結構相似，孢子均呈腎形或卵形，其分生孢子梗長度較長，分枝銳角，角度中等，呈單軸式分枝狀，頂端長有3～5 個初生小梗，分枝處縊縮，中部膨大，向上逐漸變細，頸部細長，分生孢子成熟后以假頭狀著生于頂端。菌株F4 和F5 的顯微結構相似，孢子均呈球形，分生孢子梗長度較長，分枝均為直角，單軸式分生孢子梗頂端經多次分枝產生幾輪對稱或不對稱小梗，小梗末端產生鏈狀分生孢子，整體呈掃帚狀；菌株F6 和F7 的顯微結構相似，孢子均呈紡錘形或梭形，F6 分生孢子梗長度比菌株F7 短，分生孢子梗呈直角著生于菌絲上，呈單軸式單枝狀，分生孢子成熟后以假頭狀著生于頂端。菌株F8 孢子呈球形，分生孢子梗長度最長，分枝為直角，呈單軸式單枝狀，球形孢子囊成熟后破裂釋放出孢囊孢子。

2.2.3 分子生物學鑒定 將各菌株測序所得ITS 序列在NCBI 上進行BLAST 比對，結合RDP 數據庫Classifier 進行分析（表5）。結合形態學分析的結果，發現從自然罹病死亡的云斑白條天牛幼蟲體內分離出的8 株真菌分屬于子囊菌門（Ascomycota）和接合菌門（Zygomycota），共涉及6 個屬，其中 1 株（F1）屬于蟲草屬（Cordyceps），2 株（F2、F3）屬于螺旋聚孢霉屬（Clonostachys），1 株（F4）屬于青霉屬（Penicilliums），1 株（F5）屬于籃狀菌屬（Talaromyces），2 株（F6、F7）屬于鐮刀菌屬（Fusariums），1 株（F8）屬于毛霉菌屬（Mucor）。ITS 序列鑒定結果與真菌培養性狀和菌體顯微鏡形態特征的各項指標的鑒定結果基本一致。

表5 自然罹病死亡云斑白條天牛幼蟲體內真菌的ITS 序列比對結果

2.2.4 系統發育進化分析結果 將各菌株測序所得ITS 序列進行系統發育進化分析，8 株菌株可歸類于6 個屬，分別在進化樹上形成獨立的分支，結果如圖4 所示。蟲草屬、螺旋聚孢霉屬、鐮刀菌屬和青霉屬形成一個以子囊菌門為家族的大分支，除青霉屬、籃狀菌屬（F4、F5）屬于散囊菌綱（Eurotiomycetes）的毛刷囊菌科（Trichocomaceae）外，其余均屬于糞殼菌綱（Sordariomycetes）的肉座菌目（Hypocreales），其中蟲草屬（F1）隸屬于蟲草菌科（Cordycipitaceae），螺旋聚孢霉屬（F2、F3）隸屬于生赤殼科（Bionectriaceae），鐮刀菌屬（F6、F7）隸屬于叢赤殼科（Nectriaceae）。毛霉菌屬（F8）形成一個以接合菌門為家族的大分支，屬于接合菌綱（Zygomycetes）的毛霉目（Mucorales）的毛霉科（Mucoraceae）。系統發育進化分析進一步支持了RDP Classiffier 分類結果。

圖4 基于ITS 序列的自然罹病死亡云斑白條天牛幼蟲體內真菌系統發育進化樹

3 結論與討論

本研究以自然罹病死亡的云斑白條天牛幼蟲為樣本，共分離得到了21 株細菌和8 株真菌。經鑒定，細菌歸屬于克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、產堿桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬、變形桿菌屬、普羅威登斯菌屬、檸檬酸桿菌屬、克呂沃爾氏菌屬、拉烏爾菌屬、漫游菌屬和芽孢桿菌屬12 個屬；真菌歸屬于蟲草屬、螺旋聚孢霉屬、鐮刀菌屬、青霉屬、籃狀菌屬和毛霉菌屬6 個屬。除檸檬酸桿菌屬、拉烏爾菌屬、腸桿菌屬、漫游菌屬和芽孢桿菌屬的菌株外，其余菌株的菌屬在云斑白條天牛幼蟲體內為首次報道［12，13］。

有研究表明，沙雷氏菌屬的粘質沙雷氏菌（S.marcescens）對多種昆蟲具有殺蟲作用［14］，因其本身及其次級代謝物在害蟲生物防治中的巨大潛力而廣受國內外研究學者的關注［15］。該菌可感染松墨天牛（Monochamus alternatusHope）［16］、棉鈴蟲（cotton bollworm）［17］、黃曲條跳甲（Phyllotreta striolata）［18］、瓜實蠅（Bactrocera cucurbitae）［19］和紅棕象甲（Rhynchophorus ferrugineus）［20］等多種昆蟲，而且不僅可以通過卵- 幼蟲- 蛹- 成蟲進行垂直傳播，還可以通過個體間的相互感染而進行水平傳播［21］。在毒理機制研究過程中發現，該細菌可產生多種具有高效分解幾丁質的幾丁質酶，且能抑制腸道內和血淋巴中的共生菌，進而誘發敗血癥等病癥［22］。除此之外，其代謝產物對蘇云金芽胞桿菌和白僵菌具有增效作用［23］。本研究分離到的B5 菌株與沙雷氏菌屬的同源模式菌株S. marcescens（NR114043.1）的相似率達99.93%，推測B5 菌株也具有較強的殺蟲作用。

蟲草屬真菌中的爪哇蟲草菌（C. javanica）是具有制備生物殺蟲劑巨大潛力的重要昆蟲病原菌，可寄生于鱗翅目（Lepidoptera）的Duponchelia fovealis［24］、半翅目（Hemiptera）的煙粉虱（Bemisia tabaci Gennadius）和亞洲柑橘木虱（Asian Citrus psyllid）［25］以及鞘翅目（Coleoptera）的山核桃象鼻蟲（Pecan weevil）和柑橘根象甲（Citrus root weevil）［26］等昆蟲體內；有研究發現，該菌對煙粉虱的致病性高于市場上的白僵菌和綠僵菌菌株［27］，且與天敵寄生蜂Eretmocerus hayati聯合應用比單獨應用對煙粉虱的抑制效率更高［28］。此外，螺旋聚孢霉屬中的粉紅螺旋聚孢霉菌（Clonostachys rosea）不僅是多種植物病原真菌的重要寄生菌，能用于防治紋枯病、枯萎病、莖腐病和黃萎病等［29］，而且對楚雄腮扁葉蜂［30］以及植物寄生線蟲具有較強的滅蟲活性［31］；將該菌與其他防治措施結合或與其他菌劑混合使用，還能表現出疊加效應和協同效應，實現優勢和功能互補，表現出更強的生物活性［32］。本研究分離到的 F1 和 F2、F3 菌株分別與蟲草屬和螺旋聚孢霉屬的同源模式菌株C.javanica（MT138575.1）和C. rosea（KT387608.1）、C. rosea（KJ588219.1）相似率均達100%，推測F1 和F2、F3 菌株也具有較強的殺蟲作用。

綜上所述，本研究從自然罹病死亡的云斑白條天牛幼蟲體內分離獲得的B5、F1、F2 和F3 菌株可能具有較強的殺蟲能力，有望用于開發防治云斑白條天牛幼蟲的復合生防制劑。這有待于今后開展相關菌株的殺蟲試驗和復配試驗進行驗證。