洞庭湖區(qū)可培養(yǎng)細菌群落結(jié)構(gòu)及其空間分布特征

孫 霞，劉 揚，王 芳，張 虎，毛淑敏，亓翠英

（1.山東江河濕地生態(tài)研究院，濟南 271100；2.中國水利水電科學研究院，北京 100038；3.湖南百舸水利建設股份有限公司，長沙 410007）

洞庭湖是中國第二大淡水湖，既是長江中游重要的調(diào)蓄滯洪區(qū)和重要的淡水資源儲備地，也是中國農(nóng)副漁業(yè)重要的生產(chǎn)基地，是瀕危珍稀物種的主要越冬棲息地，在維系長江中游水域生態(tài)平衡和保護生物多樣性等方面發(fā)揮重要作用。近年來伴隨洞庭湖流域社會經(jīng)濟快速發(fā)展，其水質(zhì)下降明顯，富營養(yǎng)化形勢嚴峻，2017 年監(jiān)測結(jié)果顯示，全湖水質(zhì)類別為Ⅳ類或Ⅴ類，甚至為劣Ⅴ類［1］，因此對洞庭湖實施生態(tài)環(huán)境保護及治理已刻不容緩。

微生物是湖泊生態(tài)系統(tǒng)中的重要組分，其數(shù)量大、種類多，參與湖泊生態(tài) C、N、P、S 等重要元素的物質(zhì)循環(huán)過程，在營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)利用、能量流動、維持生態(tài)平衡、改善生態(tài)環(huán)境等方面承擔著重要的角色［2，3］。有些細菌可以同時脫氮除磷［4，5］，還有些細菌可以吸收固定環(huán)境中的重金屬離子［6］，在污水處理及抗重金屬污染等方面發(fā)揮重要作用，因此，研究某一特定區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)的細菌多樣性有重要意義。

目前對湖泊生境中微生物多樣性的研究，通常采用純培養(yǎng)和免培養(yǎng)2 種方式。多位學者從太湖［7］、察爾汗鹽湖［8］等生境中分離培養(yǎng)細菌，開展群落結(jié)構(gòu)及多樣性研究，并發(fā)現(xiàn)了大量新微生物種類。自20世紀90 年代以來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展和基因組學方法的出現(xiàn)，用免培養(yǎng)方法研究湖泊中微生物多樣性的報道日益增多［9-11］，運用免培養(yǎng)方法可以消除實驗室培養(yǎng)條件的影響［12］，能比較準確地反映出環(huán)境微生物多樣性信息，為湖泊微生物多樣性的研究帶來了較大便利。但是，目前免培養(yǎng)技術(shù)只能在較高的分類水平（門或類）描述群落組成［13］，而不能在屬、種的分類水平上分析群落結(jié)構(gòu)，所以只能比較寬泛地解釋種群組成變化。另一方面，湖泊中的許多微生物以休眠狀態(tài)存在［13］，用免培養(yǎng)的方式不能區(qū)分細胞活性的差異。因此要研究微生物在湖泊中的代謝機制，獲得生態(tài)系統(tǒng)中的功能性菌種資源，僅通過免培養(yǎng)技術(shù)是遠遠不夠的，還需要純培養(yǎng)菌株，因此從湖泊生境中分離獲得獨特的菌株資源具有重要意義。

本研究以洞庭湖水體及沉積物中的細菌為研究對象，采用經(jīng)典的分離培養(yǎng)方法，獲得大量純培養(yǎng)菌株，結(jié)合16S rRNA 基因序列比對，對洞庭湖區(qū)可培養(yǎng)細菌群落結(jié)構(gòu)及空間分布進行分析，擬通過對洞庭湖區(qū)可培養(yǎng)細菌的調(diào)查，進一步了解其細菌資源現(xiàn)狀，以期為洞庭湖的微生物資源保護、開發(fā)和應用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣點描述

洞庭湖（28°44′N—29°35′N，111°53′E—113°05′E）位于湖南省北部、長江中下游荊江河段南岸，北納松滋河、虎渡河、藕池河長江三口河道分泄的洪水，西南匯湘、資、沅、澧四水。東、南、西湖水面積約2 625 km2，湖盆周長為803.2 km，總?cè)莘e約220億m3。洞庭湖區(qū)采樣點分布如圖1 所示。

圖1 洞庭湖區(qū)采樣點分布

1.2 樣品采集及物化參數(shù)的測定

本試驗所用樣品于2019 年8 月采集獲得。根據(jù)洞庭湖的形態(tài)特征，分別在東、南、西洞庭湖選取6個點，采集水樣和對應的表層沉積物（圖1）。水樣用有機玻璃采水器取樣，淺水區(qū)直接取表層水樣，深水區(qū)則取上、中、下層的混合水樣。沉積物采集使用采泥器掘取表層沉積物，用無菌金屬勺分裝于無菌塑料袋內(nèi)。水樣及沉積物采集后儲存于4 ℃保溫箱中，盡快帶回實驗室進行操作。

采樣點地理坐標利用GPS 儀測量，pH 值采用YSI 多參數(shù)水質(zhì)分析儀原位測定，氨氮、總氮、總磷等參數(shù)的測定參照國家標準進行［14］。

1.3 綜合營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)計算

綜合營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)TLI（∑）計算公式為［15，16］：

式中，TLI（∑）為綜合營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)；Wj為第j種參數(shù)營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)的相關(guān)權(quán)重；TLI（j）為第j種參數(shù)的營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)。本研究選擇葉綠素a 含量（Chla）、總氮（TN）、總磷（TP）3 個指標進行評價。貧營養(yǎng)TLI（∑）＜30；中營養(yǎng) 30≤TLI（∑）≤50；富營養(yǎng)TLI（∑）＞50；輕度富營養(yǎng)50＜TLI（∑）≤60；中度富營養(yǎng)60＜TLI（∑）≤70；重度富營養(yǎng)TLI（∑）＞70。

1.4 細菌菌株分離、純化及鑒定

用于細菌分離的培養(yǎng)基組成（L-1）為蛋白胨5 g、酵母粉 1 g、葡萄糖 0.5 g、瓊脂粉 18～20 g、洞庭湖水1 L、pH 7.0～7.5，滅菌20 min。

分離純化試驗具體操作如下：稱取10 g 沉積物樣品至 90 mL 滅菌洞庭湖水中，在 30℃、120 r/min 搖床搖勻20 min，靜置 15 min，取上清液100 μL 至分離培養(yǎng)基，涂布，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～5 d，挑取不同形態(tài)的單菌落，反復劃線純化至獲得純菌株。湖水樣品分離，取100 μL 至分離培養(yǎng)基涂布，培養(yǎng)及純化方法同沉積物樣品。

菌種的鑒定采用PCR 擴增16S rRNA 基因并在基因庫中進行BLAST 比對。菌株DNA 的提取及16S rRNA 基因擴增參照 Besaury 等［17］的方法，通用引 物 為 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′），PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至北京諾賽基因組研究中心進行測序。正反向測序拼接后獲得約1 500 bp 的序列，通過BLAST 比對，分析該菌株的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 洞庭湖上覆水及沉積物樣品理化參數(shù)分析

分析水樣及沉積物的理化性質(zhì)可以了解微生物的生活環(huán)境，洞庭湖區(qū)各采樣點的水質(zhì)理化參數(shù)及綜合營養(yǎng)狀態(tài)評價結(jié)果如表1 所示，東、南、西洞庭湖的綜合營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)分別為43.77、46.26 和48.16，皆屬于中營養(yǎng)水平，其中西洞庭湖區(qū)的營養(yǎng)化程度最高。通常Chla 的濃度代表湖泊中藻類含量，也是評價富營養(yǎng)化程度的重要指標，該研究顯示，Chla 西＞Chla 南＞Chla 東，進一步說明西洞庭湖區(qū)的污染程度更高。上覆水中氨氮及總氮的空間分布規(guī)律為南洞庭＞西洞庭＞東洞庭，其中南、西洞庭水體總氮含量均超過Ⅴ類水標準，總氮污染較嚴重。各采樣點總磷濃度在0.005～0.269 mg/L 波動，空間分布呈現(xiàn) TP 東＞TP 西＞TP 南，東洞庭湖區(qū)總磷平均濃度為0.204 mg/L，超過Ⅴ類水標準。洞庭湖水域的pH 范圍為6.91～7.24，呈中性偏堿性。

表1 采樣點的水質(zhì)理化參數(shù)及綜合營養(yǎng)狀態(tài)評價

洞庭湖東、南、西3 個湖區(qū)上覆水及沉積物的氮磷水平如圖2 所示，東洞庭湖區(qū)上覆水中的氨氮、硝態(tài)氮、總氮含量和其他2 個湖區(qū)相比為最低，但其沉積物的氨氮、硝態(tài)氮、總氮含量為最高。東洞庭湖區(qū)上覆水和沉積物中總磷含量皆高于其他2 個湖區(qū)，說明東洞庭湖總磷污染整體較重。2017 年洞庭湖水質(zhì)檢測顯示［1］，東洞庭湖水體中總磷含量高于其他2 個湖區(qū)，總氮含量低于西洞庭湖，高于南洞庭湖。有研究認為洞庭湖水體中的總氮和總磷主要來源于畜禽養(yǎng)殖、農(nóng)田徑流和城鎮(zhèn)生活污染［18］，東洞庭湖區(qū)水體中氮水平的下降，原因可能是近幾年岳陽市對東洞庭湖周邊企業(yè)及環(huán)境進行了大力整治，但由于綜合治理時間較短，在沉積物中總氮含量還未顯示明顯下降效果。

圖2 洞庭湖上覆水和沉積物中的氮磷水平

2.2 洞庭湖區(qū)可培養(yǎng)細菌種群結(jié)構(gòu)分析

從洞庭湖區(qū)共采集18 個水樣、18 個表層沉積物樣品，利用純培養(yǎng)方法從水樣和沉積物中分別獲得細菌菌株49 株和45 株，通過16S rRNA 基因序列比對分析，合并相似性98%以上的菌株為同一個種，本次所分離獲得的菌株歸屬于4 個門6 個綱10 個目12 個科17 個屬41 個種。上覆水和沉積物樣品在不同分類水平上菌群組成存在較大差異（表2），沉積物樣品在分類水平上所包含的種類少于水樣。

表2 洞庭湖上覆水和沉積物中細菌種群構(gòu)成

從門水平來看，本研究從洞庭湖水樣中分離的可培養(yǎng)細菌歸屬于4 個門，分別是變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria），其中變形菌門占所分離菌株數(shù)量的81.6%，是優(yōu)勢類群，其次是厚壁菌門，占12.2%，第三大類群是擬桿菌門，占4.1%，屬于放線菌門類群的菌株最少，僅占2.1%。沉積物樣品獲得的45 株菌株歸屬于變形菌門和厚壁菌門，其中變形菌門是絕對優(yōu)勢類群，占分離物數(shù)量的89.5%，厚壁菌門類群占10.5%。

從屬水平來看，從洞庭湖水體和沉積物中分離的可培養(yǎng)細菌隸屬于17 個屬，其中5 個屬為二者共有，8個屬為水樣特有屬，4個屬為沉積物特有屬（圖3）。水樣和沉積物樣品優(yōu)勢屬近似，分別是不動桿菌屬（Acinetobacter）（34.7%、46.7%）、假單胞菌屬（Pseudomonas）（18.4%、8.9%）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）（12.2%、13.3%）、芽孢桿菌屬（Bacillus）（8.2%、15.6%），其他屬分布較少（表3）。

圖3 水樣及沉積物樣品中共有及特有屬

洞庭湖東、南、西3 個湖區(qū)水樣和沉積物中細菌屬的分布也有差異（圖4），其中從東洞庭水體中分離到8 個屬，西洞庭分離到6 個屬，南洞庭分離到5個屬。3 個湖區(qū)水樣中都分布的屬是不動桿菌屬和假單胞菌屬，除此之外，東、南2 個湖區(qū)還有的共有屬是叢毛單胞菌屬，東、西2 個湖區(qū)還有的共有屬是芽孢桿菌屬，而西、南2 個湖區(qū)沒有其他共有屬。洞庭湖東、南、西湖區(qū)沉積物中分布的屬分別為6、5 和4 個，3 個湖區(qū)沉積物中共有屬為不動桿菌屬和芽孢桿菌屬，除此之外，東、南湖區(qū)還有的共有屬為叢毛單胞菌屬和假單胞菌屬，西洞庭湖和東、南湖區(qū)皆沒有其他共有屬。

圖4 洞庭湖3 個湖區(qū)水樣和沉積物樣品中可培養(yǎng)細菌組成（屬水平）

3 小結(jié)與討論

本研究從洞庭湖區(qū)采集的水樣及沉積物樣本中，通過純培養(yǎng)方法分離獲得94 株細菌，利用16S rRNA 基因測序方法將菌株鑒定到17 屬41 種。本研究首次對洞庭湖區(qū)的可培養(yǎng)細菌做了較系統(tǒng)的研究，結(jié)果顯示洞庭湖中存在豐富的細菌資源，且種群結(jié)構(gòu)在空間分布上差異明顯。上覆水中可培養(yǎng)細菌主要分布于變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門，沉積物中可培養(yǎng)細菌主要分布于前2 個菌門。上覆水和沉積物中的優(yōu)勢類群都是變形菌門，優(yōu)勢屬為不動桿菌屬，東洞庭湖分布的細菌種類及豐度皆高于其他2 個湖區(qū)。變形菌門作為細菌中最大的主體，在濕地［19］、湖泊［9，20，21］及深海［22］等環(huán)境中都是優(yōu)勢類群，本研究表明在洞庭湖區(qū)也是優(yōu)勢菌門。不動桿菌屬在洞庭湖水體和沉積物中皆是豐度最高的菌屬，許多研究報道不動桿菌屬在脫氮除磷中起重要作用［4，23］，是一類重要的反硝化聚磷菌，進一步說明洞庭湖區(qū)氮磷濃度較高，是微生物適應環(huán)境的結(jié)果，從而驗證了細菌種群結(jié)構(gòu)及豐度與環(huán)境因子之間的相關(guān)關(guān)系。

將3 個湖區(qū)的水質(zhì)參數(shù)進行比較，南洞庭湖水體、東洞庭湖沉積物中總氮含量最高，東洞庭湖水體及沉積物中總磷含量最高。東、南、西3 個湖區(qū)的綜合營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)分別為43.77、46.26、48.16，皆處于中營養(yǎng)水平。2013 年對洞庭湖的研究表明［24］，西、南洞庭湖TLI（∑）平均為46.16、46.80，屬于中營養(yǎng)水平，東洞庭湖TLI（∑）略大于50，屬于輕度富營養(yǎng)水平。2017 年的調(diào)查結(jié)果顯示［1］，東、南、西洞庭湖TLI（∑）平均為58.62、52.52 和53.83，都處于輕度富營養(yǎng)狀態(tài)。本研究結(jié)果表明東洞庭湖的氮含量、葉綠素a 含量及綜合營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)，皆低于其他2 個湖區(qū)，分離的菌屬種類也最多，表明東洞庭湖區(qū)的污染程度最低。整體來看，3 個湖區(qū)的營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)皆有下降，說明近幾年湖南省對洞庭湖的綜合治理已見成效，且東洞庭湖區(qū)的治理效果更為顯著。

一般而言，沉積物和上覆水2 種生境相比，沉積物中有更高的細菌群落多樣性，因為與水體相比，沉積物中有更豐富的基質(zhì)能充當微生物群落組成的非生物控制因素［25，26］，但是本研究從沉積物中分離的菌群種類及多樣性低于水體，其原因有待進一步研究。此外，本研究所獲得的細菌經(jīng)16S rRNA 基因測序，有2 個菌株（DT-6-10、DT-16-3）與已知序列的同源性在97%以下，說明洞庭湖中存在大量可能為新種或新屬的菌株，而且還篩選出多個具有較強脫氮除磷效果的菌株，部分已完成小試試驗，結(jié)果在陸續(xù)整理中。因此在后續(xù)試驗中，應不斷優(yōu)化培養(yǎng)基，改進分離培養(yǎng)方法，優(yōu)化篩選條件，才能獲得更多的微生物資源和功能性菌株，為微生物在各個領(lǐng)域的開發(fā)和應用提供基礎材料。