葉酸受體陽性循環腫瘤細胞檢測對肝細胞癌病人合并血管侵犯的診斷價值

林美龍 王文強 李劍 張二雷 黃志勇

肝細胞癌 (hepatocellular carcinoma,HCC)的血管侵犯與肝切除術后的復發、轉移有相關性[1]。HCC發生的血管侵犯主要分為大血管侵犯和微血管侵犯(microvascular invasion,MVI)[2]，大血管侵犯主要發生于門靜脈、肝靜脈、腔靜脈及其主要分支，其中門靜脈癌栓(portal vein tumor thrombus group,PVTT)是主要的大血管侵犯形式，常通過影像學檢查發現；MVI是指癌細胞見于內皮細胞襯覆的血管腔內，多見于癌旁肝組織內的門靜脈小分支[3]，只能通過病理檢查發現。循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)是指從原發腫瘤病灶脫落后進入到外周血液循環中的腫瘤細胞[4-6]。葉酸受體(folate receptor,FR)是一種表達于細胞膜表面的糖蛋白，它具有很強的組織及腫瘤特異性，在乳腺癌，肺癌，卵巢癌等多種實體腫瘤的細胞表面高表達[7-11]。有研究表明，肝原發腫瘤細胞表面的FR也有一定水平的表達[8]。本文探討FR陽性CTCs(FR+-CTCs)與HCC血管侵犯的相關性及診斷價值。

對象與方法

一、對象

2020年10月～2021年8月我院收治HCC住院病人91例。納入標準：病理學檢查確診為HCC；臨床資料完善。排除標準：合并嚴重的心肺疾病或器質性病變；合并其他腫瘤性疾病；有葉酸服用史。病人已了解且同意加入研究。本研究符合醫學倫理學要求。91例病人的一般資料見表1。根據術前影像結果和術后病理結果分為無血管侵犯(non-vascular invasion,NVI)組30例(32.97%)，MVI組26例(28.57%)，PVTT組35例(38.46%)。

二、方法

FR+-CTCs測試試劑盒(免疫磁珠負向篩選+靶向熒光定量PCR法)購于南通格諾思博生物科技有限公司。選取試管抽取4ml以上的HCC的病人的外周血液，去除紅細胞，然后用免疫磁珠的方式去除絕大多數的白細胞，剩余樣品中包含FR陽性細胞。使用特異性小分子探針對FR陽性細胞進行標記，這種特異性小分子探針由識別FR的化學小分子與寡聚核苷酸偶聯形成。在小分子探針與FR陽性細胞充分結合后，洗滌去除未結合的探針；然后洗脫受體結合的探針，用于后續定量檢測。利用熒光定量PCR，對FR結合的小分子探針中的寡聚核苷酸進行定量檢測；最終依據校準曲線定量檢測。

三、統計學方法

結果

3組病人FR+-CTCs檢測值的平均水平分別為(10.52±2.21)FU/3 ml，(12.35±2.47)FU/3 ml，(14.79±3.68)FU/3 ml，3組比較差異有統計學意義(P<0.05) 。根據Kruskal-Wallis H檢驗，不同血管侵犯類型的病人的FR+-CTCs檢測值差異具有統計學意義(P<0.05)，其中NVI和MVI的FR+-CTCs檢測值差異無統計學意義(P=0.085)，NVI與PVTT組的FR+-CTCs檢測值差異有統計學意義(P<0.05)，MVI組和PVTT組的FR+-CTCs檢測值差異無統計學意義(P=0.068)(圖1)。采用Spearman相關性分析，FR+-CTCs檢測值和HCC血管侵犯程度之間具有正相關性(r=0.499)(P<0.05)。其中FR+-CTCs檢測值與MVI之間的相關性為r=0.320(P<0.05)，FR+-CTCs檢測值與PVTT之間的相關性為r=0.571(P<0.05)。

圖1 91例HCC不同血管侵犯類型的FR+-CTCs分布范圍

繪制FR+-CTCs的ROC曲線，計算ROC曲線下面積(AUC)，FR+-CTCs診斷HCC有無血管侵犯的AUC為0.769(95%CI為0.668～0.869，P<0.05)，差異有統計學意義，其中約登指數為0.439，臨界值為12.35 FU/3 ml，敏感度為0.672，特異度為0.767。FR+-CTCs診斷MVI的AUC為0.579，P=0.312,差異無統計學意義。FR+-CTCs診斷PVTT的AUC為0.830(95%CI為0.733～0.928,P<0.05)，其中約登指數為0.562，臨界值為11.8 FU/3 ml，敏感度為0.829，特異度為0.733(圖2)。

A．91例病人發生血管侵犯的ROC曲線;B．26例病人發生MVI的ROC曲線;C．35例病人發生PVTT的ROC曲線圖2 FR+-CTCs在HCC不同血管侵犯類型的診斷效能

討論

CTCs作為一種新型液體活檢，已經在多種腫瘤病人的外周血液中檢測出，并且顯著高于健康人[12]。Cheng等[13]研究表明，CTCs對HCC具有診斷價值，與甲胎蛋白聯合檢測可以提升HCC診斷的有效性。有研究表明，通過上皮細胞黏附分子陽性的免疫靶點來識別并檢測CTCs，發現其計數的動態變化與疾病變化進展相關[14]。Yan等[15]利用體內流式細胞術動態檢測CTCs的數量變化，提出CTCs可以作為預測疾病進展和監測療效的標志物。而且高計數量的上皮細胞黏附分子陽性CTCs預示著HCC有更高的復發率和更差的生存率[16]。HCC發生血管侵犯時，腫瘤細胞可從原發病灶遷移至血管內，形成微血管癌栓或者PVTT，導致HCC切除術后5年復發率可高達40%～70%[17]。原發病灶的腫瘤細胞侵襲血管后脫落而形成CTCs是造成肝內外播散或者遠處轉移的重要原因。近年來，隨著對腫瘤表面特異性標志物的研究，發現FR具有很強的組織及腫瘤特異性，在卵巢癌、腎癌、子宮內膜癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌和胰腺癌等腫瘤中有明顯的表達，但在正常組織幾乎不表達。因此，FR作為一種新型的靶點來檢測CTCs具有很大潛力[8]。利用FR檢測CTCs在非小細胞肺癌，前列腺癌和大腸癌等惡性腫瘤上已得到應用，同時對多種腫瘤的診斷和預測療效具有重要的臨床意義[18-20]。

本研究結果表明，FR+-CTCs的檢測值與HCC的血管侵犯程度呈正相關，血管侵犯程度越嚴重，其檢測值越高，特別是發生PVTT的FR+-CTCs檢測值對比NVI的檢測值增加更明顯。FR+-CTCs對PVTT的預測價值較高，但是對MVI的預測價值較低，無法通過FR+-CTCs數值的差異將NVI和MVI區別開來。由于HCC的CTCs的FR表達量不太高，導致HCC不同程度的血管侵犯的FR+-CTCs檢測存在一定困難和遺漏，這可能是導致MVI預測價值較低的一個重要因素。

HCC?？沙霈FPVTT或門靜脈血栓(portal vein thrombosis,PVT)，臨床上通過影像學來對二者進行鑒別也有一定困難，存在一定的診斷誤差[21-22]。有研究表明，HCC合并PVTT的發生率高達44.0%～62.2%[23]；HCC通常合并肝硬化，由于血流動力學的改變，也容易出現PVT，單純肝硬化病人PVT發生率為5%～20%[24-25]，但在肝硬化合并HCC病人中PVT發生率可高達35%[26-27]。這時可以參考FR+-CTCs的數值對其加以區分，如果FR+-CTCs較高，特別是高于臨界值11.8 FU/3 ml，應該注意血管侵犯的可能性。

血管侵犯與肝切除術后腫瘤的復發率高有密切相關性，術前作出是否有血管侵犯的準確診斷對于制定合理的手術方法，優化肝切除范圍，盡早開展全身靶向及免疫治療具有重要意義。本檢測手段具有無創，簡便，快速的優點，可以在一定程度上彌補現有影像學檢查和病理學檢查滯后的短板。本研究為單中心研究，納入樣本量相對不多；FR+-CTCs的檢測數值也受多因素影響，包括檢測儀器，試劑活性和純度等。將來需要開展多中心、大樣本量的研究，進一步深入研究FR+-CTCs檢測在對MVI的預測作用，探討治療前后包括手術、靶向和免疫治療前后病人FR+-CTCs水平的變化，分析FR+-CTCs水平的變化與病人預后的相關性。