新診斷2型糖尿病患者血清非甲基化胰島素DNA水平的意義及其影響因素

王少波 包利文 尹麗明 鄧黎 付文金

1東莞市厚街醫院內分泌科，東莞 523945；2東莞市厚街醫院中心實驗室，東莞523945

有關β細胞的研究的初步結果表明，β細胞凋亡/死亡是糖尿病β細胞質量丟失的主要原因，也是1型糖尿病（T1DM）和2型糖尿病（T2DM）的共同特征。T1DM是一種自身免疫性疾病，其特點是自身反應性T細胞破壞胰島β細胞［1］。T2DM也被認為是一種先天性免疫和低度慢性炎癥性疾病，β細胞死亡可以由各種病因介導，研究顯示僅長期暴露于高血糖就能在細胞培養和動物模型中引發β細胞凋亡/死亡，一些炎癥介質已被認為參與了T2DM的β細胞凋亡［2?3］。在初診斷時T2DM患者的病理研究表明β細胞質量損失為25%～50%［4］。

最新的研究發現差異甲基化循環DNA可以作為一種新的檢測β細胞死亡的指標，具有較高的敏感性和組織特異性［5］。這些非甲基化胰島素DNA（INSDNA）在β細胞死亡或凋亡時釋放到循環中，并可在糖尿病進展過程中從血清中檢測到。非甲基化INSDNA作為一種新的β細胞死亡生物標志物，已被應用于T1DM和GDM的進展和預后評估［6?7］。另外非甲基化INSDNA還被用于監測免疫治療患者和胰島移植患者的β細胞死亡［8?11］。因此非甲基化INSDNA被很多學者認為是除了T1DM，在預測T2DM和其他類型DM患者β細胞死亡方面可能非常具有優勢［12］。故本研究選取T2DM患者為研究對象，通過液滴數字PCR技術（ddPCR）方法檢測各組血清非甲基化INSDNA及組織蛋白酶S（Cath?S）和白介素6（IL?6）水平，探討β細胞死亡在T2DM患者隨時間的變化規律及炎癥因子對其的影響。探尋合理的治療措施以延緩胰島功能的進行性惡化，更好地控制血糖，減少并發癥的發生。

資料與方法

1、一般資料

研究對象全部來自東莞市厚街人民醫院，本研究所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書，經東莞市厚街醫院醫學倫理委員會審批通過，符合倫理要求（批準文號：【2020】厚醫倫審第004號）。

本研究選擇45例新診斷2型糖尿病（NT2DM）患者、23例長病程T2DM（LT2DM）患者及20例糖耐量正常（NGT）的健康對照組，均有嚴格的入選標準。（1）納入標準：①T2DM均為符合1999年世界衛生組織（WHO）糖尿病診斷標準：糖尿病癥狀+任意時間血清葡萄糖水平≥11.1 mmol/L或空腹血糖（FPG）水平≥7.0 mmol/L或口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）中2 h血糖水平≥11.1 mmol/L；②NT2DM：口干、多飲、多尿、體質量下降癥狀和/或發現高血糖病史＜1年、未采取任何藥物干預；③LT2DM：診斷T2DM史≥1年，正在使用胰島素或口服降糖藥治療；④胰島自身抗體均陰性；⑤NGT：FPG＜6.1 mmol/L，75 g葡萄糖OGTT后2 h靜脈血糖（2hPG）＜7.8 mmol/L；⑥無糖尿病家族史。（2）排除標準：①繼發性糖尿病和其他特殊類型的糖尿病患者；②有發熱、急性感染、嚴重心臟、腎臟功能不全、缺血性的心、腦血管疾病患者；③兒童、孕婦及哺乳期婦女，有腫瘤家族史患者；④短病程糖尿病服用過降糖、降脂及抗血小板藥者。

2、方法

2.1、一般資料的收集 所有入選患者測量身高、體質量、血壓，記錄民族、性別、出生日期、聯系電話、糖尿病診斷年齡、起病時間、起病情況、既往史、吸煙史、飲酒史、糖尿病家族史及其他疾病史及發病后治療過程中的用藥情況。研究對象測量體質量時要求去除鞋帽、外衣，在空腹、排空膀胱的情況下，由專業人員測量體質量和身高。休息30 min后測量收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP），測量3次取平均值。并記錄上述指標。

2.2、檢測指標 住院當日晨起空腹（8 h以上未進飲食）靜脈采集FPG、空腹胰島素（FINS）、C肽（FC）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL?C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL?C）、肝腎功能、胰島自身抗體、Cath?S、IL?6指標。

2.3、檢測方法 非甲基化INSDNA標本采集及保存：清晨空腹取手肘靜脈血4 ml于紅色促凝管中，3 500×g離心10 min，小心吸取血清到干凈的1.5 ml管中，置?80℃保存并用其他項目的檢測。同時取靜脈血2 ml于紫色EDTA抗凝管中，3 500×g離心10 min，小心吸取血清到干凈的1.5 ml管中，置?80℃保存并用于非甲基化的檢測。非甲基化INSDNA由廣州永諾生物技術公司使用ddPCR技術檢測，包括引物和探針序列的設計、血清樣品收集、從血清中分離無細胞DNA、亞硫酸氫鹽轉化以及檢測。血Cath?S和IL?6采用ELISA法檢測。

3、統計學方法

應用SPSS19.0統計軟件進行統計學分析，計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料數據符合正態分布的以均數±標準差（±s）表示，非甲基化INSDNA、Cath?S、IL?6、FC、胰島素抵抗指數（HOMA?IR）和胰島素釋放指數（HOMA?β）等為非正態分布變量，表示為中位數（四分位間距），正態分布的連續變量兩組之間采用獨立樣本t檢驗、多組間采用單因素方差分析，非正態分布的變量應用對數（logarithm）或平方根（SQRT）轉換符合正態分布后再采用t檢驗和單因素方差分析，用Spearman相關分析比較非甲基化INSDNA與其他變量的相關性，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1、3組研究對象基線臨床資料比較

NGT組、NT2DM組和LT2DM組患者的年齡、性別構成、SBP、DBP、體質量指數（BMI）比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），具有可比性，具體見表1。NGT組無糖尿病家族史，其余各組均有糖尿病家族史，分別占33.3%和39.1%；除LT2DM組使用基本治療藥物（降糖100.0%、降壓32.1%、調脂43.4%、抗血小板34.7%）外，其余兩組入選時均未使用基本治療藥物。

2、3組研究對象血清非甲基化INSDNA、Cath?S和IL?6水平比較

NT2DM組、LT2DM組的非甲基化INSDNA水平均高于NGT組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；NT2DM組和LT2DM組的Cath?S和IL?6水平均明顯高于NGT組（均P＜0.01），NT2DM組和LT2DM組之間比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。具體見表2。

3、3組研究對象生化及胰島β細胞功能比較

NT2DM組和LT2DM組的FPG、HbA1c、TG、HDL?C均高于NGT組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；NT2DM組和LT2DM組的HOMA?β均低于NGT組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；NT2DM組和LT2DM組的HOMA?IR均明顯高于NGT組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；NT2DM組的HOMA?β高于LT2DM組，差異有統計學意義（P＜0.01）。具體見表3。

4、T2DM患者非甲基化INSDNA相關因素分析

Spearman相關分析非甲基化INSDNA水平與Cath?S呈正相關（r=0.354，P=0.017），與IL?6呈正相關（r=0.320，P=0.032），與FC呈正相關（r=0.434，P=0.003）。與FPG、HbA1c、TG、TC、HDL?C、LDL?C、HOMA?IR、HOMA?β無相關關系。

表1 3組研究對象基線臨床資料比較

表2 3組研究對象非甲基化INSDNA、Cath?S和IL?6水平比較[M（Q R）]

表3 3組研究對象生化及胰島β細胞功能比較

討 論

糖尿病（DM）是一種慢性代謝紊亂，它的病理生理學圍繞著一種獨特的程序性產生胰島素的β細胞死亡現象。臨床上DM是一種多因素疾病，隨著β細胞功能障礙或死亡而發生。在這兩種形式的DM中，DM的臨床表現只有在功能β細胞質量大量喪失之后才會出現，因此在DM診斷時再采取治療干預措施在恢復β細胞質量和功能方面的作用是非常有限的，早期發現及評估β細胞的死亡顯得非常重要。以往對DMβ細胞死亡的損失只能通過功能性研究來評估，這些功能變化不能確定導致糖尿病的主要病理過程。此外β細胞功能的測量可能受到環境因素的影響。因此，無創或微創檢測β細胞死亡非常有潛力成為早期生物標志物和用來評估治療干預措施的效果。

本研究應用ddPCR方法測定了研究對象外周血清INS基因啟動子中的?69CpG位點非甲基化水平，并通過MircoDrop?100數字平臺進行分析。結果發現在年齡、性別和BMI等匹配的情況下NT2DM患者血清非甲基化INSDNA水平最高，LT2DM患者下降。表明T2DM患者胰島β細胞的破壞在診斷為糖尿病時達到高峰，隨著病程延長逐漸下降。研究認為胰島β細胞是血清非甲基化INSDNA的重要來源［13］。因為β細胞與其他細胞類型相比，非甲基化CPG位點的頻率要高得多，并且可能在死亡時將這種DNA物種釋放到循環中［3］。

在所有類型的DM中β細胞死亡機制尚不明確，在T2DM中β細胞死亡可以由各種病因介導，包括細胞暴露于葡萄糖毒性（如高血糖和碳水化合物代謝物）、脂毒性（如TG、LDL、膽固醇和氧化產物）和促炎介質（如細胞因子）。在上述所有因素中，高血糖是最顯著的作用因素。據報道，僅長期暴露于高血糖就能在細胞培養和動物模型中引發細胞凋亡β細胞死亡，這也能通過尸檢在人類中觀察到的［14?16］。有學者認為T2DM進展性過程中，每一次高血糖的發作都會引發更多β細胞凋亡，由于本研究條件所限，樣本量少，未發現血糖與血清非甲基化INSDNA水平的相關［17］。

T2DM也被認為是一種先天性免疫和低度慢性炎癥性疾病。無論是在進行性β細胞衰竭和破壞以及外周胰島素抵抗方面，腫瘤壞死因子（TNF）α、IL?1β、IL?6家族、IL?18和某些趨化因子等低度炎癥介質已被認為參與了導致T2DM的發病過程［18］。吳曉青等［19］研究發現使用中藥聯合達格列凈治療降低了DM患者的炎癥因子，保護了胰島功能。IL?6是白細胞介素中的一種，在免疫和炎癥反應中具有重要作用，本研究結果發現T2DM患者的IL?6水平在明顯高于正常對照和糖代謝異常人群，在LT2DM患者中仍然保持較高水平，表明IL?6水平在T2DM期間長期升高［20］。IL?6可以誘導β細胞凋亡，IL?6水平越高，對β細胞損傷越重，有學者通過在高濃度IL?6中培養β細胞凋亡增加，進一步研究發現在早期糖尿病患者體內，IL?6水平升高會促進胰島分泌胰島素，引起高胰島素血癥，當持續升高達到一定水平以后，則對β細胞產生毒性作用，抑制胰島素分泌［21］。Cath?S是一種促進脂肪前分化的半胱氨酸蛋白酶，與肥胖相關的血管和代謝并發癥有關［22?24］。近年來研究發現Cath?S與T2DM的頸動脈內膜厚度及微血管并發癥有關［25］。本研究發現Cath?S在T2DM患者明顯高于非糖尿病人群，相關分析發現促炎介質Cath?S、IL?6水平的升高與血清中非甲基化INSDNA水平呈明顯正相關，我們的結果顯示Cath?S和IL?6可能參與了T2DM胰島β細胞破壞，進而促進了T2DM的發生。

血清非甲基化INSDNA主要來源于胰島β細胞死亡，本研究發現T2DM發生發展過程伴隨胰島β細胞死亡的增加，血清非甲基化INSDNA水平在NT2DM患者中較高；T2DMβ細胞死亡可能與炎癥因子等因素有關。故T2DM的早期治療及適當抗炎治療有利于更好地保護胰島功能，延緩糖尿病的進展。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突