基于計算機分子模擬技術從天然產物中篩選PPARγ激動劑

劉治國 崔文強 魏葉 朱心瑤 楊雪

1南京醫科大學附屬宿遷第一人民醫院宿遷市第一人民醫院，宿遷 223800；2東北農業大學，哈爾濱 150030；3徐州醫科大學，徐州 221004

過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）在脂肪細胞分化、葡萄糖穩態和胰島素敏感性等糖脂代謝方面中發揮著重要作用［1?2］。噻唑烷二酮類藥物（TZDs），如羅格列酮和吡格列酮，是合成的PPARγ激動劑，主要用于治療2型糖尿病［3?4］。雖然此類藥物產生的不良反應限制了其臨床應用［5?6］，但TZDs目前仍然是臨床上用于改善胰島素抵抗的重要藥物［7］。近年研究發現天然產物具有較好的抗糖尿病活性且幾乎沒有副作用，因此從植物來源的天然化合物庫中尋找潛在的藥物先導化合物或膳食補充劑成為研究熱點［8?11］。PPARγ是抗糖尿病藥物非常有吸引力的分子靶標，因此尋找新的PPARγ激動劑以增強其有益作用并減少不良反應仍有很高的研究價值。

計算機輔助藥物設計（computer?aided drug design，CADD）是通過計算機模擬藥物與受體之間的關系，是設計和優化先導化合物的重要方法，其中包括活性位點分析、數據庫虛擬篩選和全新藥物設計等［12］。近20年來，以分子對接為代表的基于結構的虛擬篩選（virtual screening，VS）已成為基于結構藥物設計的標準方法。當前基于結構的CADD廣泛應用于藥物研發［13?14］，并可預測小分子藥物與PPARγ靶點的親和力，進而反映其抗糖尿病的潛力，其中一些已表現出令人鼓舞的結果［15］。從植物來源的天然化合物庫中進行虛擬篩選具有高效、快速和經濟等優勢，不僅可以減少藥物篩選的盲目性，減少研究開發時間，還可以大大節約研究費用［16］。

2021年1月至9月，本研究中，筆者以PPARγ為關鍵靶點，通過計算機分子模擬的方式對植物來源的天然產物數據庫進行虛擬篩選，并最終通過高精度分子對接篩選出天然小分子PPARγ激動劑橙皮苷，為開發新的PPARγ激動劑或膳食補充劑提供有效的策略與思路。

材料與方法

1、軟件

本研究運用的軟件有SYBYL、OpenBabel和PyMol軟件。

2、小分子數據庫準備

本研究中，使用TargetMol公司的Natural Compound Library天然產物數據庫（全部可以購買對應的小分子標準品），其中共包含1 680個小分子化合物。首先使用OpenBabel軟件將小分子化合物的sdf格式轉化成可用于計算機分子模擬的mol2格式文件［17］，備用。

3、靶點結構準備與驗證

通過PDB蛋白晶體數據庫（https：//www.rcsb.org/）下載PPARγ的晶體結構（PDB Code：6md4），通過Discovery Studio 4.1 Visualizer對其進行編輯［18］，刪除蛋白中所有結晶水分子，并最終保留含有活性中心的蛋白A鏈，并通過SAVES（https：//servicesn.mbi.ucla.edu/SAVES/）服務器的Procheck程序對蛋白結構進行驗證以保證后續計算的可靠性。

4、計算機虛擬篩選

SYBYL是一種基于經驗（empirical?based）評分的對接程序［19］。首先通過Ligand Preparation模塊以及對前面獲得的mol2格式的小分子化合物進行加氫和動力學優化處理，選取蛋白中配體進行錨定的方法確定PPARγ的活性口袋，采用SYBYL中的Surflex?Dock Screen虛擬篩選模塊對數據庫進行虛擬篩選，其中將配體小分子作為參比分子。結果根據總分由高到低排序，查看小分子化合物與靶點活性位點的實際結合情況，選取排名前20的化合物進行下一步的高精度分子對接。

5、分子對接計算

首先對排名前20的化合物進行加氫和動力學優化，并使用虛擬篩選時確定的活性區域，采用SYBYL中的Surflex?Dock GeomX高精度模塊對小分子進行高精度分子對接，即采用受體蛋白基本剛性、配體柔性的分子對接策略進行分子對接。結果根據評分由高到低排序，綜合沖突（crash）、極性（polar）和相似度（similarity）（與原型配體的相似度）因素，查看小分子化合物與活性位點的實際結合情況，選取結合穩定的化合物進行結合并使用PyMol軟件分析作圖［20］。

結 果

1、蛋白結構圖與蛋白結構驗證

通過PyMol軟件對PPARγ的結構進行了可視化，如圖1A所示。隨后筆者通過Procheck蛋白模型對準確性進行檢測，根據對118種分辨率≥2.0?、R因子≤20%的結構進行分析，在最適區域的氨基酸占比達到了94%，可允許區域的氨基酸占比是6%（圖1B）。而一個高質量的模型在最優區域應該有超過90%的氨基酸殘基［21］，結果表明PPARγ三級模型結構合理，整個PPARγ結構域中氨基酸殘基的結構均具有高質量性，從而保證了后續計算研究的準確性。

2、蛋白活性位點的確認

圖1 PPARγ結構圖與拉氏圖；A：PPARγ蛋白結構圖；B：PPARγ蛋白結構驗證拉氏圖

在穩定可靠的三級結構的基礎上，對蛋白靶點活性位點的準確定位是虛擬篩選之前做的另一項極其重要的工作。利用軟件通過選取晶體蛋白結構中配體進行錨定的方法確定PPARγ的活性位點信息，最終確定活性位點的坐標信息如下：X 18.21，Y 63.80，Z 13.81，半徑10?。配體錨定的活性區域如圖2所示。

3、虛擬篩選結果

基于得到的PPARγ的三維空間結構（圖1），從上市藥物庫中篩選小分子PPARγ的潛在激動劑，選取蛋白結構中已知小分子作為篩選的結合位點，利用Sybyl?X2.1的Surflex模塊進行虛擬篩選。對虛擬篩選結果的選擇也十分重要，要充分考慮虛擬篩選對接結果的評分排名。本研究的篩選條件是虛擬篩選結果排名前20的化合物。

4、分子對接結果

隨后對虛擬篩選的前20名化合物進行了高精度分子對接，見表1。筆者發現橙皮苷可與PPARγ的Ser289、His323、Tyr327、Leu340、Glu343、His449、Tyr473形成氫鍵，作用距離短，作用力較強。以上對接結果充分說明小分子橙皮苷與靶點PPARγ可以相互作用，有著良好的親和力，如圖3所示。

圖2 過氧化物酶體增殖物激活受體γ蛋白活性位點

討 論

2型糖尿病的主要特征是胰島素抵抗，以PPARγ為靶點開發出羅格列酮和吡格列酮是治療肥胖2型糖尿病患者的代表性藥物。羅格列酮由于其心臟不良反應曾被黑框警示，雖然后來又撤銷了警示［22］，但其臨床應用受到了影響，而吡格列酮目前仍在臨床應用，表明PPARγ激動劑在治療2型糖尿病方面仍有重要的價值［7，23?24］。眾所周知，我國中藥資源豐富，并且具有悠久的歷史，從天然產物中篩選先導化合物，再對其進行優化改造是一種重要的藥物開發途徑［25?27］。

圖3 橙皮苷與過氧化物酶體增殖物激活受體γ相互作用圖

表1 分子對接結果

在對化合物數據庫進行虛擬篩選之前需要做大量的準備工作，包括對蛋白結構評估與驗證來確定穩定可靠的三維蛋白結構。如果蛋白質和配體均可用，基于蛋白結構進行以分子對接為代表的虛擬篩選是可行的，但關鍵問題是蛋白結構是否可用，所報道的結構是否可靠。如果蛋白質結構可以從PDB數據庫下載，就必須考慮X射線或核磁共振時的蛋白解析分辨率和獲得蛋白質晶體結構時的條件［28］。分子識別是配體結合生物大分子的基礎，蛋白晶體結構本身存在的問題可能會影響基于蛋白結構的分子模擬的結果，因此對蛋白結構進行評估與驗證是十分有必要的。本研究的PPARγ三維模型結構合理，保證了后續的虛擬篩選和分子對接足夠準確。采用的surflex分子對接方法商業認可度高，且該方法在可行性、準確度及成功率方面都明顯優于常用的開源分子對接方法。

本研究發現的小分子橙皮苷與靶點PPARγ可以相互作用，有著良好的親和力。Mahmoud［29］研究顯示橙皮苷可通過上調PPARγ消除氧化應激和炎行反應來減輕磷酰胺誘導的肝毒性，后來又發現橙皮苷通過PPARγ途徑還可預防肝癌［30］，表明橙皮苷可激活PPARγ，減輕氧化應激和炎性反應，從而發揮肝臟保護作用。Agrawal等［31］研究顯示橙皮苷可通過PPARγ途徑在糖尿病大鼠缺血性心臟病模型中產生心臟保護活性；Bhargava等［32］研究表明橙皮苷通過激活PPARγ產生抗炎、抗凋亡和抗氧化作用，從而逆轉心臟肥大。這些研究均顯示橙皮苷可通過調節PPARγ發揮保護心臟的作用。還有研究顯示：橙皮苷通過激活PPARγ預防糖尿病大鼠應激性胃潰瘍［33］，還能夠通過增加PPARγ表達，抑制NF?κB介導的炎癥，減輕呼吸機誘發的急性肺損傷［34］。許多研究已證實橙皮苷可通過PPARγ途徑發揮作用，說明本研究結果可靠。基于上述分子對接研究結果，本課題組研究發現牛蒡子苷能調節糖脂代謝減輕胰島素抵抗狀態，減少心肌膠原分泌，改善心肌纖維化［35］。

本研究為開發新的PPARγ激動劑作為藥物或膳食補充劑用于預防和治療2型糖尿病提供了新的策略與思路。此外，筆者選擇的TargetMol公司的天然產物數據庫所有化合物均已商業化，為后續工作奠定了基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突