石菖蒲、遠志及其配伍對ox?LDL誘導人臍靜脈內皮細胞損傷的影響

陳志寧 劉曉俊 唐梁 梁偉海 林國偉

廣州市第一人民醫院中醫科，廣州 511458

腦卒中是最常見的腦血管病之一。腦卒中患者不僅會有運動及感覺方面出現障礙，還可能出現認知功能障礙［1］。根據卒中后認知障礙（PSCI）的臨床表現，中醫主要診斷為“癡呆”，全國名老中醫劉茂才教授經長期臨床工作總結出癡復康方，用于治療認知功能障礙患者。研究表明，癡復康方無論在臨床或實驗中均有明顯的療效［2?3］。石菖蒲、遠志為癡復康方成分之一，石菖蒲具有開竅豁痰、醒神益智之功，遠志有養血寧心、散痰涎之功，均為治療癡呆的常用中藥。血管內皮細胞功能發生障礙是動脈粥樣硬化的起始環節，氧化型低密度脂蛋白（oxidized low?density lipoprotein，ox?LDL）可促進動脈粥樣硬化的進展［4］。2021年1月至8月，本實驗選取癡復康方中的石菖蒲、遠志，探討其對ox?LDL損傷人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的影響，進一步探討癡復康方的機制。

材料與方法

1、主要材料和儀器

1.1、材料 石菖蒲、遠志（廣州市藥材公司中藥飲片廠，批號：YPA8C0001，YPA8G0002）；ox?LDL（廣州奕元生物技術公司，批號YB?002）；胎牛蛋白（美國Gibco公司，批號1027?106）；胰蛋白酶（武漢博士德生物公司，批號PYG14190）；Propidium Iodide/碘化丙啶（上海碧云天生物技術公司，批號ST512）；RNase A酶（美國SIGMA公司，批號R4875；高純總RNA快速提取試劑盒（美國BIOTEKE公司，批號BP1201）；HiScriptⅡQRTSuperMix for qPCR（+gDNA）（美 國Vazyme公 司，批 號R223?01）；HieffTMqPCR SYBP?Green Master Mix（LoW Rox Plus）（上海翊圣生物公司，批號11202ES08）；DL2000 DNA marker（美國TAKARA公司，批號3427B）；DMEM培養基（美國HyClone公司，批號SH30809.01B）；PBS粉劑（武漢博士德生物公司，批號1027?106）；CCK?8試劑盒（碧云天）；trypsin?EDTA溶液（BIOSHARP，批號WH0518）；雙抗（青霉素/鏈霉素原液）（TBD，批號PS2004HY）；Annexin V?APC/7AADkit：（聯科生物，批號4224750）。

1.2、儀器 CW?CJ?2F型凈化工作臺（蘇州凈化有限公司）；水套式二氧化碳培養箱（美國Thermo公司）；普通光學顯微鏡（日本尼康公司）；多功能酶標儀（美國Thermo公司）；流式分析儀（愛森生物有限公司）；水平離心機（湖南湘義離心機儀器有限公司）；渦旋混勻器（其林貝爾儀器制造有限公司）；熒光定量PCR儀（杭州博日科技公司）；Tanon?1600凝膠成像系統（上海天能科技公司）；JY200C電泳儀（北京君意電泳設備公司）；超微量核算分析儀Nano?200（杭州奧盛儀器公司）。

1.3、HUVECs培養 無菌條件下，取新生兒臍帶，用0.25%胰酶注入靜脈腔內消化靜脈內皮8 min，收集消化液放至含1 ml血清的離心管，1 000 r/min離心7 min，棄上清液，混勻后放置培養箱（37℃，5%CO2）培養24 h，再次換液，待細胞融合后用0.05%胰酶進行細胞消化傳代，培養后置于培養箱（37℃，5%CO2）待用。

2、石菖蒲、遠志對ox?LDL誘導HUVECs增殖和相對活率的影響

在96孔板中接種2 000個HUVECs懸液（100.0μl/孔），置于培養箱中預培養24 h（37℃，5%CO2），棄上清，用PBS緩沖液洗2次，隨機分成5組：空白組（正常培養的HUVECs），模型組（加入80μg/ml ox?LDL的培養液），樣品組［加入80μg/ml ox?LDL的培養液及不同濃度（5、10、20 mg/ml）的石菖蒲、遠志或石菖蒲+遠志的DMEM培養液］。將其置于培養箱中培養48 h，每孔加入10.0μl CCK?8溶液，培養箱內孵育0.5～1.0 h，最后用酶標儀測定在450 nm處的吸光度檢測各孔的光密度值（A）。

3、HUVECs凋亡的測定

細胞消化，收集藥物處理后的細胞，PBS、1×Binding Buffer依次洗1次，取細胞懸液，重懸細胞，隨機分成5組，每組設3個復孔：空白組（正常培養的HUVEC），模型組（空白對照組中加入80μg/ml ox?LDL誘導），石菖蒲組（模型組中加入5 mg/L石菖蒲水煎煮物），遠志組（模型組中加入5 mg/ml遠志水煮物），石菖蒲+遠志組（模型組中加入5 mg/L的石菖蒲+遠志水煎煮物）。石菖蒲組、遠志組、石菖蒲+遠志組加入水煮物的濃度均為細胞相對活率實驗中得出的最佳濃度。每個樣品中加入100.0μl 1×Binding Buffer，加入5.0μl Annexin V?APC和10μl 7AAD，混勻后室溫下避光孵育15 min，再每管加入485.0μl預冷1×Binding Buffer重懸混合。流式細胞儀進行檢測，使用Flowjo進行數據分析。

4、HUVECs周期的測定

取生長狀況良好、密度適中的細胞，設5組，具體分組同上，每組設3個復孔，超凈臺上消化收集細胞，預冷的PBS液洗細胞2次。加預冷70%乙醇重懸，4℃環境下固定過夜，或?20℃長期固定待用；離心收集細胞，1 ml預冷PBS液洗細胞1次，加入500.0μl含5μg/ml碘化丙錠、0.2%Triton X?100、100μg/ml RNaseA的PBS，4℃避光培養30 min；流式細胞儀標準流程檢測，保證計數1×105個細胞以上；結果用細胞周期擬合軟件Flowjo分析。

5、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）法鑒定Bax、Bcl?2 mRNA的表達

取生長狀況良好、密度適中的細胞，細胞分組同上，設5組，每組設3個復孔，引物設計見表1，提取總RNA，超凈臺上收集各組細胞沉淀，提取RNA，準備PCR反應管，依次在管中加入20.0μl反應體系，具體流程為7.4μl ddH2O在94℃下預變性1 min，10.0μl SYBR在94℃下變性15 s，1.0μl cDNA在60℃下退火20 s，1.6μl在72℃延伸20 s，變性、退火、延伸流程循環40次，結果用相對定量法進行分析。

6、統計學分析

實驗數據采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析。實驗數據以(±s)表示，組間均數比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 實時熒光定量聚合酶鏈式反應法鑒定Bax、Bcl?2 mRNA的表達的引物設計

結 果

1、細胞增殖與細胞相對活率

模型組與空白組相比較，其相對活率下降，提示ox?LDL誘導細胞損傷模型制備成功。不同濃度的單種藥組中，5 mg/ml石菖蒲、5 mg/ml遠志細胞增殖OD值及細胞活率最佳；聯合用藥組以5 mg/ml的效果最優；其中，相同的藥物濃度下，聯合用藥組細胞活率優于單種藥。單藥和聯合用藥，隨著用藥濃度增加，細胞相對活率均下降。此步驟得出石菖蒲低劑量組、遠志低劑量組、石菖蒲+遠志藥對低劑量組為最佳濃度。見表2。

表2 石菖蒲、遠志對ox?LDL誘導HUVECs增殖和相對活率的影響（±s）

表2 石菖蒲、遠志對ox?LDL誘導HUVECs增殖和相對活率的影響（±s）

注：與空 白 組 比 較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；ox?LDL為氧化型低密度脂蛋白，HUVECs為人臍靜脈內皮細胞；“?”表示無數據

組別空白組模型組石菖蒲低劑量組石菖蒲中劑量組石菖蒲高劑量組遠志低劑量組遠志中劑量組遠志高劑量組石菖蒲遠志藥對低劑量組石菖蒲遠志藥對中劑量組石菖蒲遠志藥對高劑量組細胞增殖OD值0.899±0.003?0.973±0.008a 0.966±0.052a 0.878±0.042 0.977±0.012a 0.794±0.054a 0.605±0.025a 0.940±0.035 0.803±0.029a 0.544±0.017a細胞相對活率98.733±0.451 88.1±0.608a 93±0.721ab 89.567±2.237 83.9±4.014 93.4±1.114 75.9±5.142 57.8±2.339ab 103.06±2.815 76.767±2.730a 52.033±1.678ab

2、細胞凋亡

數據顯示，模型組的凋亡率較空白組顯著增高，提示模型制備成功。與模型組相比，石菖蒲組的凋亡率顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；遠志組、石菖蒲+遠志組的凋亡率顯著降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見圖1、表3。

圖1 各組人臍靜脈內皮細胞凋亡結果；A為空白組人臍靜脈內皮細胞凋亡結果，B為模型組人臍靜脈內皮細胞凋亡結果，C為石菖蒲組人臍靜脈內皮細胞凋亡結果，D為遠志組人臍靜脈內皮細胞凋亡結果，E為石菖蒲+遠志組人臍靜脈內皮細胞凋亡結果

表3 各組人臍靜脈內皮細胞凋亡率比較（±s）

表3 各組人臍靜脈內皮細胞凋亡率比較（±s）

注：與空白組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05

組別空白組模型組石菖蒲組遠志組石菖蒲+遠志組凋亡率（Q2+Q3%）0.338±0.001 4.319±0.124a 2.694±0.561ab 2.278±0.914ab 2.250±0.699ab

3、細胞周期

與空白組相比，模型組、石菖蒲組、遠志組的（S+G2）%期降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與模型組相比，石菖蒲組、遠志組、石菖蒲+遠志組的（S+G2）%期增高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與石菖蒲組相比，石菖蒲+遠志組的（S+G2）%期增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與遠志組相比，石菖蒲+遠志組的（S+G2）%期增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2、表4。

表4 各組人臍靜脈內皮細胞（S+G2）%期比較（±s）

表4 各組人臍靜脈內皮細胞（S+G2）%期比較（±s）

注：與空白組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05

組別空白組模型組石菖蒲組遠志組石菖蒲+遠志組（S+G2）%64.145±3.033 42.745±4.052a 52.055±2.920ab 54.867±1.880ab 62.065±1.881b

4、Bax、Bcl?2 mRNA表達量

石菖蒲、遠志及其配伍對ox?LDL誘導HUVECs下Bax、Bcl?2 mRNA的表達量與空白組相比，模型組的Bax mRNA表達量升高，Bcl?2表達量下降，提示模型制備成功。與模型組相比，石菖蒲組、遠志組、石菖蒲+遠志組的Bax mRNA表達量下調，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與模型組相比，石菖蒲組、遠志組、石菖蒲+遠志組的Bcl?2表達量升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表5。

表5 各組人臍靜脈內皮細胞Bax、Bcl?2 mRNA表達量比較（±s）

表5 各組人臍靜脈內皮細胞Bax、Bcl?2 mRNA表達量比較（±s）

注：與模型組比較，a P＜0.05

組別空白組模型組石菖蒲組遠志組石菖蒲+遠志組n3 3 3 3 3 Bax表達量0.373 3±0.040 4 1.040 0±0.020 0 0.856 7±0.068 1a 0.756 7±0.061 1a 0.623 3±0.030 6a Bcl?2表達量3.330 0±0.080 0 1.056 7±0.086 2 1.563 3±0.165 0a 1.940 0±0.045 8a 2.086 7±0.129 0a

討 論

動脈粥樣硬化是由多個因素作用下發生的慢性炎癥過程，血液中的多種脂質均可對血管內皮造成損傷，尤其是低密度脂蛋白（LDL）發生氧化后對動脈粥樣硬化的發生發展起到極其重要的作用［5］。由于動脈粥樣硬化導致血管管腔狹窄甚至閉塞，從而出現缺血性腦卒中等血管性疾?。?］。有研究表明，缺血性腦卒中后的患者出現認知功能障礙的發生率可高達80.97%［7］。同時有研究表明，高脂血癥可導致血管炎性反應，腦血流量調節功能受損，從而影響PSCI的發生［8］。因此，抑制高脂血癥導致的血管內皮細胞損傷在PSCI患者中尤其重要。

圖2 各組人臍靜脈內皮細胞（S+G2）%期；A為空白組人臍靜脈內皮細胞（S+G2）%期，B為模型組人臍靜脈內皮細胞（S+G2）%期，C為石菖蒲組人臍靜脈內皮細胞（S+G2）%期，D為遠志組人臍靜脈內皮細胞（S+G2）%期，E為石菖蒲+遠志組人臍靜脈內皮細胞（S+G2）%期

癡復康方是全國名老中醫劉茂才教授數十年經驗總結出的治療癡呆的代表方，由石菖蒲、遠志、天麻、法半夏、黃芪、當歸、何首烏、紫河車、巴戟天等藥物組成。石菖蒲具有開竅豁痰、醒神益智的功效，中藥石菖蒲的主要有效成分為β?細辛醚，具有保護血管內皮、調血脂、降低血液黏度、抗血小板聚集等作用［9］。研究表明，β?細辛醚可有效抑制ox?LDL對ECV304的損傷［10］。還有研究顯示，β?細辛醚減少細胞凋亡的機制可能是通過穩定線粒體膜來實現的［11］。遠志具有養血寧心、散痰涎的功效，具有抗癡呆、腦保護等療效［12］。遠志的主要活性成分是遠志皂苷元，具有抗氧化、抗衰老、改善阿爾茨海默病的藥理作用［13?14］。石菖蒲?遠志為常用的中藥藥對，現代藥理學表明，其可通過多種成分、多個靶點、多條路徑改善阿爾茨海默?。?5］，同時可通過調節Aβ和自噬水平改善慢性顱腦低灌注［16］。

有研究表明，Bax與Bcl?2兩種蛋白在細胞凋亡與生長周期中具有拮抗作用，Bcl?2具有抗凋亡作用，而Bax具有促凋亡作用［17］。研究可采用Bax與Bcl?2蛋白來評估血管內皮細胞受損情況［18］。本研究結果顯示，ox?LDL損傷血管內皮細胞可使細胞凋亡率升高，細胞增殖下降。予適量石菖蒲、遠志及其配伍水提物干預后可使細胞凋亡率下降，細胞增殖指數升高，同時Bax mRNA表達量下降、Bcl?2 mRNA的表達量升高，提示石菖蒲、遠志及其配伍水提物可能通過調控兩種凋亡蛋白的表達來抑制血管內皮細胞的凋亡。

本實驗中，通過對癡呆復康方拆方，探討石菖蒲、遠志及其藥對配伍對血管內皮細胞的作用，認為石菖蒲、遠志均對血管內皮細胞有保護作用，其配伍藥對優于單味中藥。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突