擬除蟲菊酯類農藥及其代謝物免疫檢測技術研究進展

許梓紅，羅林，陳子鍵，王炳志，嚴義勇，孫遠明，徐振林*

1(廣東省食品質量安全重點實驗室，華南農業大學 食品學院，廣東 廣州，510642)2(深圳市易瑞生物技術股份有限公司，廣東 深圳，518000)

擬除蟲菊酯是從野菊花中提取的天然除蟲菊酯的合成衍生物，由菊花酸酯以及其酸和醇的鹵化衍生物所組成[1]。擬除蟲菊酯殺蟲劑都含有酸基、中心酯鍵和醇基，其中酸基含有2個手性碳，因此擬除蟲菊酯通常以立體異構化合物(反式和順式)的形式存在[2]。擬除蟲菊酯的毒性與其結構有關，順式異構體通常比反式異構體毒性更大。根據在大鼠體內的毒性信號，將擬除蟲菊酯分為Ⅰ型和Ⅱ型，其結構見表1，主要差別是Ⅱ型菊酯類農藥的醇基α碳上連著氰基。然而，某些擬除蟲菊酯(如氰菊酯、氟菊酯)卻無法進行這樣的分類，它們會同時產生這2種毒性信號[3-4]。擬除蟲菊酯類農藥進入人體后會快速代謝，發生酯鍵斷裂和氧化作用生成cis/trans-3-(2,2-二氯苯乙烯基)-2,2-二甲基環丙基-1-羧酸和3-苯氧基苯甲醇，3-苯氧基苯甲醇進一步氧化成3-苯氧基苯甲酸(3-phenoxybenzoic acid, 3-PBA)[5]。

表1 擬除蟲菊酯分類Table 1 Classification of pyrethroids

菊酯類農藥是一種神經毒劑，Ⅰ型和Ⅱ型擬除蟲菊酯具有不同的神經毒性，其原理主要是對電壓門控鈉離子通道造成干擾。研究表明，擬除蟲菊酯類農藥屬于內分泌干擾物，可通過飲食攝入進入人體[6]。具有生殖毒性、神經毒性、免疫系統毒性，甚至會導致腫瘤發生[7]。3-PBA是一種結構穩定、難以降解的雌激素類物質，會導致擬除蟲菊酯類農藥生物礦化作用受阻，從而阻止了擬除蟲菊酯類農藥完全轉化為無毒小分子物質，危及人體健康[8]。因此，我國制定并頒布實施了一系列關于擬除蟲菊酯類農藥安全使用和殘留限量檢測標準。GB 27779—2011《衛生殺蟲劑安全使用準則 擬除蟲菊酯類》規定了衛生殺蟲劑擬除蟲菊酯的安全使用準則，如規定溴氰菊酯、氯氰菊酯和氯菊酯等不宜在桑園、魚塘、河流、養蜂場等處及其周圍使用，使用時要采取一般防護措施。我國最新國家標準GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》規定聯苯菊酯在根莖類和薯芋類蔬菜中的最大殘留限量為0.05 mg/kg，氟氰戊菊酯在梨、蘋果中的最大殘留限量為0.5 mg/kg等；歐盟標準EU441/2012規定聯苯菊酯在番茄中的最大殘留量為0.3 mg/kg，馬鈴薯中氰戊菊酯和高效氯氟氰菊酯的最大殘留量分別為0.02和0.01 mg/kg等。

目前，檢測擬除蟲菊酯及其代謝物的方法有很多。傳統檢測方法有氣相色譜法[9]、高效液相色譜法[10]，色譜和質譜聯用技術[11]等，但是這些儀器分析方法所需要的儀器昂貴，樣品前處理復雜，且檢測時間長，不能滿足現場檢測的要求。應用免疫學檢測技術來進行農殘檢測可以彌補傳統分析方法的不足，實現低成本、高通量的現場快速檢測。因此，近些年來免疫學分析方法迅猛發展，為擬除蟲菊酯及其代謝物的檢測帶來了福音。本文將在解析當前擬除蟲菊酯類農藥半抗原和抗體制備方法的基礎上，就免疫檢測新方法在擬除蟲菊酯檢測中的應用現狀進行綜述，并簡要介紹該方法在食品安全快速檢測中的應用。

1 半抗原的設計合成

1.1 常規設計思路

擬除蟲菊酯類農藥相對分子質量小于1 000，單獨存在時不具有免疫原性，需要與載體蛋白結合后才可以作為免疫原。由于大部分擬除蟲菊酯類農藥沒有能與蛋白質結合的活性基團，需要對其結構進行改造或合成其結構類似物，再與蛋白質偶聯形成人工抗原。從結構上看擬除蟲菊酯類農藥分子有3個連接載體蛋白的結合位點，分別為環丙烷基衍生物結合位點，—H(Ⅰ型)或—CN(Ⅱ型)和3-苯氧苯基衍生物結合位點。按照結合位點設計合成半抗原有以下4種途徑[12]，如圖1-A所示。(1)在菊酯的環丙烷部位接上連接臂：其中采用氧化擬除蟲菊酯環丙烷部位的烯基團為羧酸的方法是制備半抗原較常用的方法。HUA等[13]用高錳酸鉀將聯苯菊酯分子中環丙烷上的雙鍵氧化為羧基；(2)將菊酯的R2位點上的氰基水解為羧酸作為連接位點，再連接含有—NH2的多碳化合物或氨基酸。張獻忠[14]合成溴氰菊酯并將R2位點上的氰基轉化為羧基合成了半抗原；(3)將連接臂設計在苯醚基末端，有3種方式：一是直接在苯氧苯基對位上衍生出3碳的羧酸；二是直接在苯氧苯基對位上衍生出一個—NH2；三是將苯氧基由某種羧酸取代，形成末端如苯氧乙酸的結構；(4)將菊酯分解成菊酸或苯氧苯甲酸，將其作為半抗原。SONG等[15]將氰戊菊酯分解成2-(4-氯苯)-3-甲基丁酸，再和氨基己酸甲酯酸化合成半抗原；LU等[16]利用擬除蟲菊酯代謝物苯氧苯甲酸合成半抗原3-(3-苯氧基-過氧化苯甲酰胺)-丙酸。關于擬除蟲菊酯半抗原設計合成的報道如表2所示。

A-擬除蟲菊酯合成半抗原四種常規途徑；B-氯菊酯代謝物半抗原分子建模圖1 擬除蟲菊酯半抗原的設計合成Fig.1 The design and synthesis of pyrethroid haptens

表2 擬除蟲菊酯半抗原的設計合成Table 2 Design and synthesis of pyrethroid haptens

1.2 計算機模擬輔助設計策略

上述半抗原設計方法是基于對抗體結合位點和抗原表位的分子結構以及發揮作用的分子間結合力的理解而預測的，設計的結果需通過動物實驗進行測試，其方法具有不確定性且耗時較長。近年來，為了以更快速和更經濟的方式獲得親和力和特異性高的抗體，也有研究者利用計算機輔助分子建模(computer aided molecular modeling, CAMM)預測半抗原的結構，利用CAMM可以得到分子結構和生物活性等信息，而這些分子結構和生物活性是很難或不可能獲得的。在大多數研究中，通過設計了幾個候選半抗原，再利用CAMM對其進行優化，并計算價態和電荷。優化后選擇結構和電荷與目標分析物最接近的半抗原作為免疫半抗原。一般情況下，通過此方法獲得的抗體對目標分析物具有較高的敏感性和特異性，與其他類似物的交叉反應性較低[24]。AHN等[25]設計合成了氯菊酯代謝物的4種不同類型的免疫半抗原，并借助化學辦公軟件研究合成半抗原的幾何結構，選擇幾何形狀與分析物相匹配的半抗原進行免疫。實驗證明，將與目標分析物的幾何結構相似的半抗原進行偶聯，免疫產生的抗體特異性更高，如圖1-B所示。HUANG等[26]通過計算機模擬10種擬除蟲菊酯的3D模型，發現特定三維構象對分子印跡聚合物的識別能力有重要影響。因此，使用分子建模技術可以輔助半抗原設計，以開發靈敏的免疫分析方法。

2 抗體制備與鑒定

擬除蟲菊酯類農藥抗體的制備途徑主要有：應用合成的人工抗原免疫大白兔產生多克隆抗體；利用人工抗原免疫小鼠，提取出其脾細胞與骨髓瘤細胞融合，篩選出高特異性的單克隆抗體；結合噬菌體展示技術獲得的重組抗體；通過分子印跡技術獲得的仿生抗體。

2.1 傳統多/單克隆抗體

多克隆抗體制備簡單、研制成本低，但由于免疫動物的個體差異而特異性、親合性不穩定，容易產生批間差異。張獻忠[14]合成了溴氰菊酯的4種人工抗原，免疫動物獲得多克隆抗體，并建立了溴氰菊酯免疫親和色譜-高效液相色譜檢測方法。ZHANG等[17]制備了擬除蟲菊酯殺蟲劑的4種多克隆抗體，并獲得了對Ⅰ和Ⅱ擬除蟲菊酯殺蟲劑均有同等高敏感性的最佳抗體包被組合，IC50為0.02 μg/mL，并用于水樣中擬除蟲菊酯殺蟲劑的檢測。單克隆抗體具有特異性強、性質均一等優點，易于大量生產。與多克隆抗體相比，單克隆抗體具有更強的識別特異性, 且這種特異性可人為篩選。HUA等[13]建立了一種靈敏的單克隆抗體酶聯免疫吸附法，用于檢測土壤化學屏障中的聯苯菊酯。其檢出限和IC50分別為0.004 mg/L和0.05 mg/L，與基于多克隆抗體的ELISA相比，敏感性提高了40倍。WANG等[19]利用單克隆抗體建立了一種靈敏、廣泛的選擇性直接競爭酶聯免疫吸附法，用于擬除蟲菊酯的檢測，通過對添加擬除蟲菊酯的河流水樣進行分析，回收率為74%～108%。

2.2 重組抗體

重組抗體是繼多克隆抗體和單克隆抗體之后的第3代抗體，小分子重組抗體一般包括Fab、Fv和scFv等，如圖2-A所示。與傳統抗體相比，重組抗體更穩定、親和力更高，抗體制備周期短適合大規模生產，可實現分子水平的定向改造。吳元元等[18]利用基因工程技術制備了擬除蟲菊酯類農藥可溶性單鏈可變區抗體，并通過實驗證明，scFv抗體對氯菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯均有較高特異性，IC50分別為3.29、4.72、5.55 μg/mL。常繼辰[23]利用噬菌體抗體庫技術和基因工程技術，制備了擬除蟲菊酯單鏈抗體，結果表明所得單鏈抗體對氰戊菊酯具有一定的結合活性。

2.3 納米抗體

納米抗體是由駱駝科動物缺失輕鏈的天然重鏈抗體的可變區(variable domain of heavy chain of heavy chain antibody,VHH)組成的單域抗體，其可變區的相對分子質量約為15 kDa，如圖2-B所示。與傳統抗體相比，納米抗體具有相對分子質量小、親和力高、穩定性高、溶解性好、免疫原低、穿透力強、人源化簡單等優勢[27-28]。KIM等[20]以擬除蟲菊酯殺蟲劑的主要代謝物3-PBA為目標建立了基于VHHs的免疫分析。其構建了噬菌體VHH文庫，通過與3-PBA競爭性結合篩選出7個VHH克隆。實驗結果顯示其IC50為1.4 ng/mL，檢測限為0.1 ng/mL，這表明利用免疫羊駝的序列和噬菌體展示技術進行抗體選擇特異性和敏感性高。ZHAO等[21]利用噬菌體文庫分離出一種廣譜特異性納米抗體用于檢測擬除蟲菊酯，結果表明，氯氰菊酯、β-氯氰菊酯和氰戊酸酯的IC50分別為2.586、1.814、2.251 g/mL，該方法克服了用人工抗原免疫動物制備抗體的局限性。WANG等[22]利用基因重組技術獲得納米抗體，基于此將其應用于熒光偏振免疫分析技術，對擬除蟲菊酯的代謝物3-PBA進行了檢測。

A-傳統抗體、重組抗體和納米抗體結構圖；B-VH與VHH序列比較圖圖2 納米抗體結構圖Fig.2 Structure of nanoantibody

2.4 仿生抗體

分子印跡技術是指合成的聚合物與目標分子通過共價、非共價或半共價相互作用特異性結合的技術[29]，通過分子印跡技術得到的仿生抗體穩定性好、特異性高。季芯羽等[30]制備了一種分子印跡熒光傳感器用于菊酯類農藥代謝物間苯氧基苯甲醛的選擇性測定，其檢出限為0.267 μmol/L。HUANG等[19]合成了一種能識別10種擬除蟲菊酯的雙假模板分子印跡聚合物，用于檢測雞肉樣品中的擬除蟲菊酯，檢測限為0.3～6.0 pg/mL。CAI等[31]合成了擬除蟲菊酯的分子印跡微球和熒光示蹤劑，用于測定羊肉和牛肉樣品中10種擬除蟲菊酯，檢出限為6.4～17 ng/mL。

3 新型免疫學檢測方法

鑒于免疫學分析方法可以彌補傳統分析方法的不足，因此許多擬除蟲菊酯已經建立了新型免疫學檢測方法，關于擬除蟲菊酯及其代謝物的新型免疫檢測方法研究概況見表3。

表3 擬除蟲菊酯及其代謝物的新型免疫學檢測方法Table 3 Novel immunological assays for pyrethroids and their metabolites

3.1 側流免疫層析技術

免疫層析技術的原理是以條狀纖維膜為固相，通過吸水墊的毛細管虹吸效應，使樣品中待測抗原或抗體與層析膜上對應的受體(抗體或抗原)發生高特異、高親和性的免疫反應，形成的免疫復合物被截留在檢測帶，通過酶促反應顯色或著色標記物顯色，快速得到可視化結果。隨著研究的深入，除了常見的膠體金之外，研究者也開發出新的靈敏度更高的標記物。COSTA等[32]制備了一種抗體門控指標釋放材料，將其固定在試紙條上，與智能手機讀數相結合，用于檢測擬除蟲菊酯。所用的傳感材料結構及其工作原理和試紙條的結構(圖3)。這種傳感材料有許多優勢，例如孔徑大小更適應抗體，局部半抗原連接和聚乙二醇功能化，有助于微米大小的支架顆?？梢栽诓挥绊憚恿W或空白釋放的情況下使用。此外，使用聚乙二醇玻璃纖維膜、3D打印支架和智能手機，可以在2 min內檢測到分析物，檢測限降低到1 ng/mL，此方法適合于其他的分析物和各種現場分析。

A-傳感材料結構；B-試紙條組成結構及檢測原理；C-側流免疫檢測結合手機讀數圖3 檢測擬除蟲菊酯的側流免疫層析技術原理圖Fig.3 The schematic diagram of side-flow immunochromatography for the detection of pyrethroids

3.2 熒光免疫法

隨著世界各國對擬除蟲菊酯殘留限量標準越來越嚴格，迫切需要提高免疫學檢測技術的靈敏度，因此科研工作者開發出了更加靈敏的熒光免疫分析法。熒光免疫分析法在高特異性免疫學反應的基礎上，結合了熒光技術的靈敏性，具有靈敏度高、準確性好，易實現高通量、自動化檢測等優勢。其原理是當制備好的熒光探針在發生特異性的免疫反應后，其熒光強度或與待測物質的量相關，或因大小、距離的變化而發生改變[42](圖4)。目前在擬除蟲菊酯及其代謝物的檢測中常用的熒光標記物有熒光素、量子點、熒光納米顆粒等。

A-熒光素結構式；B-量子點結構；C-熒光免疫法原理圖4 熒光免疫法Fig.4 Fluorescence immunoassay

熒光素[43]是常見的有機染料小分子，具有水溶性好、量子產率高、摩爾吸光系數高、無毒和成本低等優點。FENG等[33]以羅丹明染料的激光誘導熒光作為標記，采用微滴熒光猝滅競爭性免疫分析法對河水中的高氰戊菊酯進行檢測。研究表明，高氰戊菊酯與羅丹明的結合物顯示出與純羅丹明類似的熒光，加入高氰戊菊酯抗體后，熒光減弱。再將含有高氰戊菊酯的樣品加入到微滴中時，會使熒光信號恢復，檢測下限為0.1 nmol/L。

量子點是1～10 nm的半導體晶體，通常由硅、硒化鎘、砷化銦或硫化鎘等材料組成，被光源照射后會產生特定的顏色[44]。劉景坤[34]制備出碲化鎘量子點，建立新型熒光標記免疫檢測技術對蔬菜中的氰戊菊酯進行檢測，線性范圍為0.06～3.83 μg/mL。XIAO等[35]制備了具有自定義選擇性人工識別位點量子點的分子印跡二氧化硅層，建立了基于量子點的酶聯免疫吸附方法對魚中的氯氰菊酯進行檢測。實驗結果表明其檢測下限為1.2 μg/kg。

為了提高擬除蟲菊酯及其代謝物的檢測靈敏度，近年來也有研究通過采用新型材料如熒光納米顆粒分離和標記抗體。納米材料的尺寸極小，其具有許多優良的生物學和理化特性，如良好的生物相容性、表面效應、量子尺寸效應等，因此在生物領域內被廣泛使用[45]。邱浩[36]將窄發射譜和高熒光量子產率的有機染料作為熒光團，以納米SiO2顆粒為載體,在表面包覆印跡層，制備了一種熒光印跡復合材料用于檢測環境中的三氟氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯和氟胺氰菊酯。

3.3 免疫傳感器法

免疫傳感器技術是將免疫檢測技術和傳感技術相結合的一種新型生物傳感器技術，分為非標記性免疫傳感器和標記性免疫傳感器(圖5)。非標記性免疫傳感器是利用待測的抗原或抗體能夠與固定在傳感器表面的識別元件發生特異性結合并形成穩定的復合物，再通過換能器將免疫反應的變化轉化為光電信號，光電信號經過記錄和處理后可實現對待測物的定量檢測。標記性免疫傳感器則是采用酶、熒光試劑、同位素、金屬標記物等本身可使免疫反應產生信號的標記物來實現定量檢測待測物[46]。FRUHMANN等[37]開發了安培免疫傳感器在海水不進行任何預處理的情況下檢測溴氰菊酯，檢測下限為4.7 μg/L。WANG等[38]開發了非標簽阻抗法免疫傳感器對茶葉中氰戊酸酯進行檢測，通過殼聚糖與玻碳電極上改性的戊二醛交聯，將氰戊菊酯抗體固定在電極上，用電子轉移電阻的增大來測定氰戊酸酯的含量, 檢出限為0.80 μg/L。

A-免疫傳感器工作原理；B-標記型免疫傳感器檢測原理示意圖；C-非標記型免疫傳感器；D-用于檢測3-PBA的納米電化學免疫傳感器的 制備工藝及傳感機理圖5 免疫傳感器原理圖Fig.5 The schematic diagram of immunosensor

將傳感器與納米材料聯合可以顯著提高檢測的靈敏度和特異性。EL-MOGHAZY等[39]制備了一種新型的超靈敏納米體電化學免疫分析法，用于檢測尿液中擬除蟲菊酯代謝物3-PBA。通過采用絲網印刷電極將游離的3-PBA與3-PBA-BSA偶聯物共價固定在檸檬酸修飾的尼龍納米纖維上，通過直接競爭與堿性磷酸酶包埋的納米體結合，實現了對人尿中3-PBA的檢測，檢出限為0.64 pg/mL。

近年來，在免疫傳感技術中，免疫芯片發展迅速。免疫芯片是將高特異性的免疫反應與電子芯片技術相結合的一種高通量、高特異性的新型生物檢測技術[47]。免疫芯片技術主要采用微陣列點樣法將抗原抗體固定于玻片、硅膠板或多孔板上，使其高度集成，然后進行免疫反應[48]。趙穎等[40]以載玻片為固相載體，將包被抗原共價結合固定在載體上，以膠體金為標記材料，單克隆抗體為識別元件，用銀增強試劑放大信號，建立了甲氰菊酯等10種常見農藥多殘留的免疫芯片檢測方法。蘭美靜[41]以硝酸纖維素膜為載體，抗原為捕獲探針，膠體金為標記材料，制備了可同時檢測甲氰菊酯等9種常見農藥的可視化免疫芯片。

4 應用現狀及展望

在擬除蟲菊酯類農藥及其代謝物半抗原設計上，由于擬除蟲菊酯農藥大多有手性碳原子和多種光學異構體，抗原決定簇較多，這對擬除蟲菊酯單抗的制備造成了一定的困難。因此在設計擬除蟲菊酯半抗原結構時，可結合計算機輔助分子建模預測半抗原的結構，設計出具有光活性的半抗原。其次，擬除蟲菊酯結構相似性高，且部分擬除蟲菊酯類農藥具有多種光學異構體，因此存在抗體間交叉率較高的問題，為了提高抗體的特異性，在設計半抗原時應突出其與其他擬除蟲菊酯不同的結構，解決交叉反應的問題。

抗體制備及篩選是免疫學檢測技術的核心，通過傳統方法免疫動物獲得的單/多克隆抗體生產周期長，篩選出的抗體適應性較差，并不能適用于所有的免疫檢測技術。相對與傳統抗體，基因工程抗體制備周期短，操作簡化，可以實現分子水平定向改造和抗體的多功能化；而仿生抗體重點解決了特異性和穩定性問題，在前處理應用方面有應用前景，是未來抗體制備的發展方向。因此可使用基因工程抗體、仿生抗體等代替傳統抗體用于食品中的擬除蟲菊酯類農藥及其代謝物的檢測。

免疫學檢測技術具有快速、敏感性和特異性強等特點，在農藥殘留方面的檢測得到了廣泛的應用。隨著擬除蟲菊酯類農藥越來越多地被應用到農業和家庭殺蟲，應用免疫學方法對其進行定性和半定量檢測，從而實現對擬除蟲菊酯的控制和評估顯得尤為重要。進一步提高檢測的靈敏度是利用免疫技術檢測擬除蟲菊酯類農藥及其代謝物的未來發展趨勢。隨著生物技術和納米材料的發展，可應用新型的標記材料如脂質[49]、鐵氧化殼硅核磁性納米復合材料[50]等，實現對擬除蟲菊酯及其代謝物進行高通量檢測，也可結合多種標記材料制成新型多功能材料來標記目標分子，以提高其檢測靈敏度。隨著免疫學技術發展不斷深入和完善，免疫學技術將在擬除蟲菊酯類農藥及其代謝物的快速檢測方面得到更加廣泛的應用，為人類的公共衛生、營養健康與疾病預防作出更大的貢獻。