基于實(shí)時(shí)質(zhì)譜快速監(jiān)控牦牛肉水煮過程中羧甲基賴氨酸和羧乙基賴氨酸的生成

張聰，叢夢(mèng)，傅小玲，黃琴，李偉麗，陳伍志，吳韜*

1(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都，610039)2(四川紅原溜溜牛食品有限責(zé)任公司，四川 阿壩藏族羌族自治州，624400)

美拉德反應(yīng)是指還原糖類等羰基化合物和氨基化合物之間的反應(yīng)，其除了會(huì)賦予食品獨(dú)特的風(fēng)味和誘人的色澤，還會(huì)產(chǎn)生糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation endproducts，AGEs)等有害物質(zhì)[1]。AGEs 在食品中廣泛存在并通過攝入的食品積累在體內(nèi)，有研究表明食品中羧甲基賴氨酸[Nε-(carboxymethyl)lysine，CML]、羧乙基賴氨酸[Nε-(carboxyethyl)lysine，CEL]是體內(nèi)AGEs 的主要來源[2]，AGEs 的積累會(huì)使人體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)糖尿病、腎病、動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茲海默癥等疾病的誘發(fā)有著重要影響[3]。相對(duì)于低 AGEs 含量的飲食，攝取 AGEs 含量較高的食物容易引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎病的發(fā)生[4]。因此檢測(cè)與限制調(diào)控食品中的AGEs對(duì)于保障食品安全具有重要意義。目前報(bào)道的檢測(cè)方法主要為酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[5]、熒光檢測(cè)法[6]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)[8]。ELISA準(zhǔn)確度低，多用于檢測(cè)總的AGEs含量；熒光檢測(cè)法則一般用于能夠自發(fā)熒光的AGEs的檢測(cè)；GC-MS需要在測(cè)試前將樣品進(jìn)行復(fù)雜的衍生化；LC-MS/MS則需要復(fù)雜的前處理，需要使用固相萃取小柱對(duì)AGEs進(jìn)行凈化[9]，單次進(jìn)樣需要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的色譜分離，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

實(shí)時(shí)直接分析質(zhì)譜(direct analysis in real time mass spectrometry，DART-MS)是一種開放式離子化質(zhì)譜技術(shù)[10], 其主要結(jié)構(gòu)包括DART離子源、軌道式進(jìn)樣器及質(zhì)譜(圖1)。該技術(shù)優(yōu)點(diǎn)在于，對(duì)樣品前處理要求較低、不需要色譜分離，因此能夠?qū)悠愤M(jìn)行高通量檢測(cè)[11]。近年來，DART-MS已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域[12]。本研究以水煮牦牛肉為研究模型，擬建立一種基于DART-MS/MS技術(shù)的CML和CEL高通量快速檢測(cè)方法，并考察外源性抗氧化食品原料苦蕎、藤椒對(duì)牦牛肉水煮過程中CML、CEL生成的影響。研究結(jié)果將為食品中CML和CEL高通量快速檢測(cè)、開發(fā)高品質(zhì)牦牛肉產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛肉，四川省溜溜牛食品有限公司；苦蕎粉、藤椒粉，市售。

CML標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%，加拿大TRC公司)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；甲醇(色譜級(jí))，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；正己烷、NaNO2、AlCl3·6H2O，成都市科隆化學(xué)品有限公司；高純N2、高純He，成都泰竽工業(yè)氣體有限公司。

圖1 DART-MS檢測(cè)系統(tǒng)Fig.1 DART-MS determination system

1.2 儀器與設(shè)備

DART離子源，美國(guó)Ionsense公司；SCIEX 3500 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，美國(guó)AB SCIEX公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精確稱取CML標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解、稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為50.0、30.0、20.0、10.0、5.0、1 μg/mL 的CML標(biāo)準(zhǔn)溶液[13-14]。

1.3.2 牦牛肉樣品的準(zhǔn)備

將50 g牦牛肉均勻切成1 cm3大小的塊，加入200 mL冷水中進(jìn)行煮制，煮制時(shí)分別加入牦牛肉質(zhì)量0%(對(duì)照組)、10%、30%和50%的苦蕎粉或藤椒粉，12 min后取出。每組3個(gè)平行。

1.3.3 牦牛肉中CML與CEL的提取

參考ZHANG等[15]和HEGELE等[16]的研究：取煮制后的牦牛肉5 g剁碎，將剁碎后的牦牛肉樣品放于50 mL離心管中，加入20 mL預(yù)冷后的20 g/L三氯乙酸水溶液，除去蛋白沉淀。將上清液采用正己烷脫除油脂，將下清液置于真空離心濃縮機(jī)進(jìn)行濃縮干燥，加入2 mL甲醇水溶液(體積比8∶2)復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm 微孔有機(jī)濾膜過濾后裝入樣品瓶中，備用。

1.3.4 苦蕎、藤椒總黃酮的測(cè)定

根據(jù)REMIREZ等[17]的研究方法略作修改后測(cè)定苦蕎粉和藤椒粉中的黃酮含量。結(jié)果以毫克蘆丁當(dāng)量每100g干物質(zhì)(mg RE/100g DW)計(jì)。

1.3.5 質(zhì)譜條件

DART SVP離子源條件：采用高純He為工作氣體；DART離子源與質(zhì)譜儀距離2 cm，進(jìn)樣針移動(dòng)速度為0.6 mm/s；進(jìn)樣體積1 μL。質(zhì)譜條件：正離子掃描模式，去簇電壓40 V，碰撞能量20 V。

1.4 計(jì)算方法

1.4.1 基質(zhì)效應(yīng)的計(jì)算

通過公式(1)計(jì)算牦牛肉樣品中CML的基質(zhì)效應(yīng)。

(1)

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，使用GraphPad Prism 8進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CML和CEL的二級(jí)質(zhì)譜裂解行為及定量離子對(duì)選擇

預(yù)試驗(yàn)表明，CML、CEL均在正離子模式下才有信號(hào)，因此，本研究均采用質(zhì)譜正離子模式進(jìn)行測(cè)試。為了降低CML、CEL的檢出限，需要對(duì)CML、CEL二級(jí)質(zhì)譜裂解行為進(jìn)行研究，選擇合適的定量檢測(cè)離子對(duì)[多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(multiple reaction monitoring，MRM)]。對(duì)牦牛肉樣品中CML、CEL分別進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，其二級(jí)質(zhì)譜圖見圖2。

a-CML二級(jí)質(zhì)譜圖；b-CEL二級(jí)質(zhì)譜圖圖2 牦牛肉樣品中CML、CEL的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 DART-MS/MS fragments of CML and CEL

由于CML與CEL僅僅相差1個(gè)—CH2結(jié)構(gòu)，其二級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律非常類似。本文僅以CML的二級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律為例進(jìn)行解析。如圖2和圖3所示，CML的分子離子峰為m/z205。碎片m/z130是m/z205經(jīng)歷氫重排后，脫去1個(gè)氨基乙酸基團(tuán)形成的；碎片m/z84是由m/z130脫去1個(gè)—HCOOH形成；m/z142 是由m/z205依次脫去—H2O、—CO，電子遷移形成雙鍵后脫去—NH3形成。由于碎片m/z130為最強(qiáng)信號(hào)峰，因此CML選擇205～130為定量離子對(duì)，CEL選擇219～130為定量離子對(duì)。

圖3 樣品中CML二級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律Fig.3 DART-MS/MS cracking law of CML

2.2 DART-MS條件優(yōu)化

在DART-MS測(cè)試樣品的過程中，解析氣體的溫度會(huì)顯著影響待測(cè)樣品組分的電離效率[18]。因此，本研究考察了解析氣體的溫度對(duì)CML一級(jí)母離子(m/z205)響應(yīng)強(qiáng)度的影響。如圖4-a所示，隨著氣體溫度從 300 ℃逐漸升至 450 ℃時(shí)，CML響應(yīng)強(qiáng)度逐漸升高；當(dāng)溫度升至 500 ℃時(shí)，CML的響應(yīng)強(qiáng)度開始下降。因此，選用450 ℃為解析氣體的最優(yōu)溫度。

柵網(wǎng)電極電壓能夠減少空氣中的雜質(zhì)離子，可以減少質(zhì)譜圖上的背景干擾[19]。本研究考察了100～300 V的柵網(wǎng)電極電壓對(duì)待測(cè)組分響應(yīng)強(qiáng)度的影響。如圖4-b所示，CML的響應(yīng)強(qiáng)度在150 V時(shí)信號(hào)強(qiáng)度最大，隨后CML母離子響應(yīng)強(qiáng)度逐漸降低。因此，選擇150 V為最優(yōu)的柵網(wǎng)電極電壓。

去簇電壓的大小會(huì)顯著影響CML(m/z205)母離子的響應(yīng)強(qiáng)度。本實(shí)驗(yàn)考察了10～50 V 去簇電壓對(duì)m/z205離子響應(yīng)強(qiáng)度。如圖4-c所示，隨著去簇電壓的增加，CML的響應(yīng)強(qiáng)度先增大后減小，當(dāng)去簇電壓為40 V時(shí)，CML母離子峰的響應(yīng)強(qiáng)度最高。因此，選擇40 V為實(shí)驗(yàn)的去簇電壓。

質(zhì)譜的碰撞能量也能顯著影響CML(m/z205)二級(jí)碎片離子的信號(hào)強(qiáng)度。因此，選擇合適的碰撞能量值對(duì)目標(biāo)物的定量分析有著十分關(guān)鍵的作用。本研究采用m/z130作為CML的定量離子，以二級(jí)碎片離子m/z130的響應(yīng)強(qiáng)度作為指標(biāo)對(duì)碰撞能量值進(jìn)行優(yōu)化。如圖4-d所示，隨著CE值的增大，m/z130的響應(yīng)強(qiáng)度先增大后減?。幌噍^于碰撞能量值為15 V時(shí)，碰撞能量值為20 V時(shí)，二級(jí)碎片離子的峰形更佳，且母離子碎裂更加充分，綜合考慮，選擇20 V作為CML定量分析的碰撞能量。

a-溫度；b-柵網(wǎng)電極電壓；c-去簇電壓；d-碰撞能量圖4 基于DART-MS測(cè)定CML的測(cè)試條件優(yōu)化Fig.4 Optimization of test conditions for CML determination based on DART-MS

采用優(yōu)化好的質(zhì)譜條件對(duì)CML標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)試，采用MRM模式，以m/z205～m/z130作為定量離子對(duì)，如圖5所示，在2 min內(nèi)即可完成8次平行樣品的測(cè)定。由于CML與CEL屬于同系物，其理化性質(zhì)非常相近，采用傳統(tǒng)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)方法檢測(cè)，色譜分離需要 10 min以上，而 DART-MS/MS方法無色譜分離過程，在常壓下能夠直接進(jìn)樣，可以大幅縮短分析時(shí)長(zhǎng)。

圖5 CML 8次平行進(jìn)樣的總離子流圖Fig.5 Total ion chromatography diagram of eight parallel injections of CML

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限(detection limit，LOD)及定量限(quantification limit，LOQ)

如圖6所示，以峰面積為縱坐標(biāo)，CML質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)R2。CML在 1～50 μg/mL，R2為0.996 3，表明線性關(guān)系良好。LOD為0.1 μg/g，LOQ為0.5 μg/g。這表明本方法能有效地對(duì)CML進(jìn)行檢測(cè)，具有良好的靈敏度。

圖6 CML標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of CML by DART-MS

2.3.2 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中除目標(biāo)組分以外的組分在電離過程中，對(duì)目標(biāo)成分可能產(chǎn)生離子增強(qiáng)或者抑制效應(yīng)[20]?；|(zhì)效應(yīng)在定量分析中可能會(huì)嚴(yán)重影響待測(cè)物的精密度和準(zhǔn)確性，因此需要研究 DART-MS 方法測(cè)定CML的基質(zhì)效應(yīng)。

由于缺少商業(yè)化的空白基質(zhì)(不含CML的牦牛肉)，因此本研究采用自由態(tài)AGEs的提取液直接溶解CML標(biāo)準(zhǔn)品，然后使用樣品提取溶液對(duì)其進(jìn)行連續(xù)稀釋。最終牦牛肉中CML加標(biāo)質(zhì)量濃度為8.17～53.17 μg/mL，具體見表1。

表1 方法的線性參數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限及定量限Table 1 Linear parameters，matrix effect，detection limit and quantification limit of the method

當(dāng)|基質(zhì)效應(yīng)|≤ 20 時(shí)，可以認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)較弱[21]。由表1可知，牦牛肉中CML的基質(zhì)效應(yīng)為-15.63%，表明牦牛肉中的基質(zhì)對(duì)CML含量有輕微抑制作用，但是影響不顯著，可以直接采用CML的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

2.3.3 回收率與精密度

在樣品中添加50、20、5 μg/g 3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的目標(biāo)分析物(表2)，每個(gè)添加量平行測(cè)定5次，分別測(cè)定加標(biāo)回收率和精密度。精密度用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)表示。結(jié)果如表2所示，整體上CML的平均回收率為100.77%～117.36%，RSD為8.22%～9.87%。因此，DART-MS 方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性較好，可用于快速檢測(cè)樣品中CML的含量。

表2 方法的加標(biāo)回收率與精密度(n=5)Table 2 Results of standard recovery rate and precision of the method

2.3.4 苦蕎和藤椒對(duì)牦牛肉中CML、CEL生成的影響

苦蕎和藤椒中含有多種黃酮類物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，總黃酮含量與抗氧化活性成正相關(guān)。本文采用的苦蕎粉中總黃酮含量為142.23 mg RE/100g DW，藤椒中總黃酮含量604.86 mg RE/100g DW。由于CML與CEL結(jié)構(gòu)近似，采用上述建立的 DART-MS/MS快檢方法對(duì)牦牛肉樣品中的CEL含量進(jìn)行估測(cè)(以CML計(jì))。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，加入苦蕎粉煮制后的牦牛肉中的CML和CEL含量逐漸降低，對(duì)比空白樣，添加牦牛肉質(zhì)量50%的苦蕎粉煮制后，樣品中CML含量降低7.72%，CEL含量下降1.46%，具有顯著性差異；而加入牦牛肉質(zhì)量50%藤椒粉煮制后的牦牛肉CML含量相較于空白樣品降低了14.51%，CEL含量卻增加7.35%，差異極顯著，這可能是由于藤椒中富含蘇氨酸，在AGEs生成過程中參與了CEL前體物質(zhì)丙酮醛的生成，導(dǎo)致CEL含量增多。前人研究也發(fā)現(xiàn)，在蛋白質(zhì)糖化早期，木犀草素等黃酮成分能夠抑制AGEs形成[22]。苦蕎、花椒中均含有多種黃酮類物質(zhì)[23-24]，這可能是加入苦蕎粉后牦牛肉中CML、CEL均顯著下降的原因。

a-苦蕎粉添加量；b-藤椒粉添加量圖7 苦蕎粉、藤椒粉添加量對(duì)AGEs的影響Fig.7 Effect of tartary buckwheat and zanthoxylum schinifolium powder on AGEs 注：ns表示無顯著差異(P>0.05)；*表示差異顯著(P<0.05)； **表示差異極顯著(P<0.01)

3 結(jié)論

與UPLC-MS/MS方法相比，DART-MS方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，單次樣品測(cè)定時(shí)間小于30 s，能大幅縮短分析時(shí)長(zhǎng)，并且不使用流動(dòng)相，具有環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)。消減工藝研究結(jié)果表明，苦蕎可以同時(shí)有效減少牦牛肉在煮制過程中CML和CEL的生成；藤椒能有效減少牦牛肉在煮制過程中CML含量，但卻增加了CEL含量，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。