超高效液相色譜-串聯質譜法測定蜂王幼蟲中煙酰胺單核苷酸的含量

趙彤，趙洪木，宋美潔，杜偉，吳黎明，范芳芳，薛曉鋒*

1(中國農業科學院蜜蜂研究所，北京，100093)2(云南省農業科學院桑蠶蜜蜂研究所，云南 紅河哈尼族彝族自治州，661100) 3(安捷倫科技(中國)有限公司，北京，100102)4(老滇凰生命科學院，江蘇 蘇州，215000)

蜂王幼蟲，也稱蜂王胎，是蜜蜂受精卵消化吸收工蜂分泌的新鮮蜂王漿后生長而成的幼蟲，是蜂王漿加工的副產品，其凍干粉中含有約50%的粗蛋白和人體必須氨基酸，同時含有豐富的維生素、礦物質、生物活性酶等成分，具有極高的營養價值[1]。研究證實，蜂王幼蟲具有抗衰老[2]、抗氧化[3]、提高免疫力[4]等功效，作為一種昆蟲食品，其在保健和功能食品行業具有重要的開發應用價值和廣闊的市場前景。開展蜂王幼蟲功能組分挖掘及研究，對于促進蜂王幼蟲新資源功能性產品的開發與應用具有重要意義。

煙酰胺單核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)合成的重要前體物質，其功能作用通過體內轉化為NAD+實現[5-6]，主要包括參與多種疾病的預防，如Ⅱ型糖尿病、肥胖癥和心力衰竭等，是醫藥、功能性食品、化妝品等行業的珍貴原料[7-9]。2016年，代謝領域研究最有影響的刊物《Cell Metabolism》報道給實驗鼠補充飼喂NMN可有效減輕小鼠與年齡相關的生理衰退，在沒有任何明顯毒性或有害影響的情況下，NMN可抑制與年齡相關的體重增加，可增強能量代謝，促進體力活動，改善胰島素敏感性和血脂水平，并改善眼功能和其他病理性疾病，證明了NMN在抗衰老方面的巨大潛力[9-10]。食品或功能產品中NMN的準確測定方法是監測產品中NMN含量和評價其功能的關鍵。已有研究表明，蜂王幼蟲富含核苷酸類物質，而核苷酸類物質是蜂王幼蟲正常生長發育的必要物質之一[11]，但尚無關于蜂王幼蟲中NMN的研究報道。

因此，為了快速準確測定蜂王幼蟲中NMN的含量，本文優化了NMN的提取方法，建立了超高效液相色譜-串聯質譜法(ultra-high performance liquid chromatographic tandem mass spectrometry，UHPLC-MS/MS)測定蜂王幼蟲中NMN的分析方法。應用方法測定實際蜂王幼蟲樣品中NMN的含量，并研究其在不同貯存條件下的穩定性，以期為蜂王幼蟲NMN含量分析和功能應用，以及蜂王幼蟲產品的質量控制提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1 mL離心管、50 mL離心管，康寧生命科學(吳江)有限公司；甲酸銨、甲酸，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；乙醇、甲醇：色譜純，美國MREDA公司；蜂王幼蟲LDH1和蜂王幼蟲LDH2、蜂王幼蟲凍干粉LDH-P1，老滇凰原料基地蜂場；其他幼蟲樣品S1～S9，浙江蜂場隨機取樣；煙酰胺單核苷酸標準品：純度>95%，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

6495 Agilent超高效液相色譜串聯質譜儀，美國Agilent公司；高速離心機，湖南湘儀有限公司；渦旋混勻器，美國Scientific Industries公司；十萬分之一分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準工作溶液的配制

精密稱取NMN標準品適量，用蒸餾水配成1 mg/mL的標準儲備液。將儲備液稀釋成質量濃度分別為50、100、250、500和1 000 ng/mL的標準工作溶液。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取新鮮蜂王幼蟲樣品5 g或凍干粉1 g于50 mL 離心管中，加入15 mL乙醇，渦旋混合2 min，后加入15 mL蒸餾水，渦旋混合5 min，轉移至50 mL容量瓶，蒸餾水定容。取出適量溶液，在8 000 r/min離心4 min，取上清液用蒸餾水稀釋至原質量濃度的1/50，后經0.22 μm尼龍濾膜過濾，待上機檢測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Waters X Select HSS T3(2.1 mm×100 mm，2.5 μm)；流動相A為5 mmol/L甲酸銨水溶液(含0.4%甲酸，體積分數)，流動相B為甲醇；洗脫程序：0～3 min，0% B；3～4 min，0% B～90% B；4～8 min，90% B；8～10 min， 90% B～0% B；柱溫：40 ℃，進樣量：1 μL，流速：0.2 mL/min。

1.3.4 質譜條件

離子源：離子漏斗，電噴霧離子源(electron spray ionization，ESI)，正離子模式；掃描方式：多反應監測(multiple reaction monitoring，MRM)；干燥氣溫度220 ℃；干燥氣流速15 L/min；霧化器壓力40 psi；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速12 L/min；毛細管電壓3 500 V；噴嘴電壓500 V。

1.3.5 蜂王幼蟲中NMN的穩定性研究

用1.3.2的提取方法、1.3.3的色譜條件和1.3.4的質譜條件，測定-18、4 ℃和常溫條件下貯存0、1、2、3、4、5、6、7 d的蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉中NMN的含量。

2 結果與分析

2.1 樣品提取條件的優化

蜂王幼蟲中含有大量的蛋白質，會影響NMN的提取和測定，因此，在提取NMN前，需先進行蛋白質的沉淀。本實驗分別對比了甲醇、乙醇和乙腈對蛋白質沉淀能力，結果表明，乙醇可以有效沉淀蜂王幼蟲樣品中的蛋白質。圖1展示了NMN的結構式，可見其分子中包含2個裸露的—OH，親水性強，因此，選擇水為NMN的提取溶劑最合適。另外，通過比較實驗發現當乙醇和水的體積比為1∶1時，沉淀蛋白和提取效果最佳。實際樣品中NMN含量較高，在上機分析前需要將提取液進一步稀釋(1/50～1/100)倍，此步驟可以明顯降低基質影響，實現樣品中NMN的準確測定。

圖1 NMN的結構式Fig.1 The chemical structural of NMN

2.2 色譜與質譜條件的優化

為優化分離，本實驗對比了不同體積分數甲酸銨水溶液、甲酸-甲酸銨水溶液、不同體積比的甲醇、乙腈組成的流動相以及4種色譜柱：Agilent Infinitylab Poroshell 120 HILIC-Z(2.1 mm×100 mm, 2.7 μm)(下文簡稱HILIC-Z)、Halo AQ-C18(2.1 mm×50 mm, 2 μm)(下文簡稱AQ-C18)、Agilent Infinitylab Poroshell 120 HILIC-OH5(2.1 mm×100 mm, 2.7 μm)(下文簡稱HILIC-OH5)和Waters X Select HSS T3(2.1 mm×100 mm, 2.5 μm)(下文簡稱HSS T3)的分離效果，根據NMN的分離度、響應值和色譜峰型，選擇最佳的分離條件。結果發現，水相中加入甲酸和甲酸銨，不僅能提高NMN的響應值，還能改善峰型，甲醇為流動相時響應比乙腈更高。HILIC-Z分離時，峰型較差，AQ-C18和HILIC-OH5對NMN的保留能力弱，且與基質無法有效分離，HSS T3分離時，峰型尖銳對稱，無拖尾現象。因此，選擇含0.4%甲酸的5 mmol/L甲酸銨水溶液-甲醇溶液為流動相，選擇HSS T3為分離色譜柱。圖2為NMN標準溶液的色譜圖。

圖2 NMN標準溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of the NMN standard solution

NMN結構上包含1個伯胺，容易生成[M+H]+離子，故選擇電噴霧正離子(ESI+)掃描方式，根據[M+H]+離子找到準分子離子峰，進一步對NMN的[M+H]+離子進行子離子掃描，優化碰撞能量、駐留時間及離子加速電壓，在MRM模式下選取響應高，離子比穩定的離子作為監測離子對，優化得到離子對與文獻報道一致[12]，可以滿足NMN的準確定性和定量。具體質譜條件優化結果見表1。

表1 NMN的保留時間及質譜分析條件Table 1 Retention time of NMN and its MS/MS acquisition settings

2.3 線性范圍、檢出限(limits of detection，LOD)、定量限(limits of quantitation，LOQ)

采用優化后的參數進行UHPLC-MS/MS方法學研究，以NMN的峰面積為縱坐標(Y)，對應質量濃度為橫坐標(X)繪制標準曲線，結果表明，NMN標準品在50～1 000 ng/mL呈現良好的線性關系。根據信噪比確定LOD(S/N=3)以及LOQ(S/N=10)分別為11.2 μg/kg和37.4 μg/kg。

2.4 NMN提取液穩定性實驗

稱取樣品，用1.3.2的方法制備提取液，按照1.3.3的色譜條件和1.3.4的質譜條件，分別在0、3、6、18、24 h測定NMN的含量，并計算降解率，測定結果見表2。

表2 提取液的降解率 單位：%

結果表明，NMN提取液在24 h 后的降解率為4.87%，供試樣品溶液在24 h內穩定，樣品在提取完成后應在24 h內測定完成。

2.5 回收率實驗

由表3可知，在20、40和80 μg/g 3個添加水平下，NMN的添加回收率在109.9%～111.2%，RSD在0.87%～3.31%，說明建立的方法具有很好的準確度和精密度，可以滿足蜂王幼蟲中NMN的準確測定。

表3 NMN加標回收率Table 3 Standard recovery of NMN

2.6 實際樣品含量測定

按照上述優化方法對蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉進行檢測，圖3為樣品的總離子流圖(total ion chromatography，TIC)，圖4為樣品中NMN的MRM圖譜。蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉中NMN的含量見表4。

圖3 樣品的TIC圖Fig.3 TIC chromatogram of sample

圖4 樣品中NMN的MRM圖譜Fig.4 MRM chromatogram of NMN in sample

表4 蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉中NMN含量Table 4 NMN content of queen bee larva and frozen dry powder of queen bee larva

由表4可知，蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉中均含有NMN。其中，蜂王幼蟲凍干粉中NMN含量更高，為78.0 μg/g，LDH1和LDH2樣品(試驗蜂場)中NMN含量分別為65.8 μg/g和62.5 μg/g，隨機蜂場采集的樣品S1～S9中NMN的含量為37.0～49.0 μg/g。蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉樣品中NMN的含量差異可能與蜂種、飼養方式、飼料類型以及幼蟲的采集和貯存條件相關。

與文獻報道的其他食品中NMN含量(0.1～3.3 μg/g)相比[13]，蜂王幼蟲中NMN的含量高出普通食品10～80倍，可以作為補充NMN的食品或功能產品資源。此外，NMN可能對蜂王幼蟲正常發育起重要作用[14]，其含量也可能影響蜂王健康和壽命，相關的研究還需要進一步開展。

2.7 蜂王幼蟲NMN的穩定性測定

為確定蜂王幼蟲中NMN在貯存期內的降解情況，分別于0、1、2、3、4、5、6、7 d，測定-18、4 ℃和常溫條件貯存的蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉中NMN含量，結果見表5。

表5 蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉在不同貯存條件下 NMN的降解率Table 5 NMN degradation rate of queen bee larva and frozen dry powder of queen bee larva with different storage condition

由表5可知，蜂王幼蟲在常溫保存時，隨著時間的延長NMN出現快速降解，在第7天降解率達到96.4%；在4 ℃保存時，降解速率較常溫要慢，但在第7天仍可達到了88.5%；在-18 ℃保存時，蜂王幼蟲中的NMN在7 d內未降解。蜂王幼蟲凍干粉在常溫、4和-18 ℃保存，7 d內均未降解。說明常溫和非冷凍條件(4 ℃)不利于蜂王幼蟲中NMN的保存，低溫或凍干可有效控制蜂王幼蟲中NMN的降解。蜂王幼蟲中NMN的降解可能與NMN腺苷酰轉移酶的作用有關，在適當條件下，將NMN轉化為NAD。凍干粉或-18 ℃低溫保存可以抑制蜂王幼蟲中的腺苷酰轉移酶發揮作用，從而使其無法將NMN轉化為NAD。已有研究報道，由于NAD的分子質量較大，無法通過口服攝取至細胞內，而NMN可有效補償隨年齡增長帶來的體內NAD含量下降[9]。合理的保存和加工方法可保護蜂王幼蟲中NMN不被降解，對于保持蜂王幼蟲及其產品的品質和功能活性具有重要意義。

穩定性實驗發現，蜂王幼蟲NMN極易降解，所以在采集蜂王幼蟲樣品后，應該將其及時冷凍或制成凍干粉以減少NMN的降解。作為重要的功能組分，NMN也可以作為蜂王幼蟲及其產品新鮮度和品質評價的潛在指標。

3 結論

論文通過優化蜂王幼蟲中NMN的提取方法和分析條件，建立了UHPLC-MS/MS方法，并對蜂王幼蟲及其凍干粉樣品中NMN的含量進行測定。方法快速簡單，靈敏度高，在3個質量濃度添加水平下，平均回收率為109.9%～111.2%，方法的RSD為0.87%～3.31%，可以實現蜂王幼蟲中NMN的準確測定。應用建立的方法，測定了蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉樣品中NMN的含量，并連續測定7 d不同貯存條件下NMN的含量變化。實際樣品中均檢出NMN，新鮮蜂王幼蟲的NMN含量為37.0～65.8 μg/g，蜂王幼蟲凍干粉中NMN的含量為78.0 μg/g。與文獻報道其他產品相比，蜂王幼蟲中NMN含量遠高于其他常見的食品，可以作為重要的NMN補充食物來源。貯存試驗結果顯示，在常溫或4 ℃條件下，蜂王幼蟲中的NMN快速降解，蜂王幼蟲樣品應該在采集后-18 ℃冷凍貯存或加工為蜂王幼蟲凍干粉，以有效保護NMN不被降解。作為重要的功能成分，NMN也可作為蜂王幼蟲及其產品的功能性或新鮮度的潛在評價指標，用于產品的質量控制。本研究建立的方法也為蜂王幼蟲產品的進一步開發利用以及NMN在蜂王發育過程中的作用研究提供重要的技術支撐。