基于蛋白質材料的3D打印技術研究現狀及其應用

邵婷，馮鑫，呂天藝，王洪霞，馬良，戴宏杰，張宇昊

(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)

3D打印技術又稱為“增材制造”技術，是一種新穎的快速成型技術，陜西省把培育發展3D打印產業集群列入了“十四五”規劃中。通過3D打印技術打印出的產品形狀由計算機輔助設計軟件來控制，從理論上來講可以得到任何形狀的產品[1]?；谶@一特點，3D打印技術在醫藥、航天、工業等領域均得到了應用[2]。

蛋白質是人類生命活動中不可缺少的八大營養素之一，不少學者都將其作為打印油墨應用于3D打印食品和組織工程領域中。這是因為蛋白質作為打印油墨不僅能豐富打印材料中的氨基酸組成，提高打印產品的營養特性[3]，還對打印油墨的可打印性起到了改善作用。例如，在含有酪蛋白酸鈉的打印油墨中加入適量的牛奶濃縮蛋白，能夠增強酪蛋白酸鈉纏結狀的分散網絡結構，促進凝膠結構的形成[4]。在食品領域中，蛋白質油墨以乳制品最為常見，這可能與乳制品中蛋白質含量豐富且乳品種類多樣(生乳、奶粉、奶酪)有關。在組織工程領域中，蛋白質油墨以明膠的應用最為廣泛，這可能是因為明膠可以為細胞提供營養且細胞在明膠上具有較好的附著性[5]。3D打印技術的打印類型多樣，應用最廣泛的有熱熔/空氣擠出，選擇性激光燒結，粘合劑噴射和噴墨打印[6]。在基于蛋白質原料的3D打印技術中，熱熔/空氣擠出技術最為常見，這與部分蛋白質具有良好的凝膠特性(如明膠[7])和可以改善混合打印油墨流動性(如蛋黃蛋白[8])的性質有關。

目前，國內外已有較多關于3D打印技術類型、3D打印油墨類型的相關總結，但有關蛋白質材料的類型(質構調整型蛋白質、組織框架型蛋白質、營養補充型蛋白質)、影響因素(流變學性質、機械參數)和應用領域(食品、組織工程領域)的研究性綜述還尚未見探討。因此，本文從3D打印蛋白質類型、影響因素和應用上進行了概括與探討，旨在為蛋白質在3D打印領域更廣泛、更成熟的應用提供理論支持與借鑒。

1 基于適用方向的3D打印蛋白質類型

蛋白質在油墨體系中起著不同的作用(表1)，因此本文基于蛋白質的適用方向將其分為質構調整型蛋白質、組織框架型蛋白質和營養補充型蛋白質三類。

表1 用于3D打印的蛋白質材料Table 1 Protein materials for 3D printing.

1.1 質構調整型蛋白質

可打印性是3D打印技術中打印材料需要具備的重要特征之一，它不僅要求打印材料能從噴嘴中順利擠出，還要求打印產品可以在打印平臺上良好支撐。3D打印通?？刹捎命S原膠[21]、淀粉[13]、面粉[22]等大分子增塑材料，但單一材料往往不具備優異的可打印性。例如，用15%的淀粉打印出的產品自支撐性較差，產品底部會隨著時間推移而逐漸流動，這對產品的精度造成了負面影響[13]。為了提高油墨的可打印性，可以加入蛋白質來對油墨的流變性、黏彈性進行改善。改善后的混合油墨更適合擠壓，并能在后處理過程中保持目標形狀?；诖宋覀儼涯芨纳朴湍纱蛴⌒缘牡鞍踪|稱作為質構調整型蛋白質。當擠出的油墨在平臺上難以自支撐時，可以向油墨中加入牛奶濃縮蛋白，以增加油墨的機械強度，這是因為牛奶濃縮蛋白質顆粒膨脹后會聚集形成質地較硬的網狀結構。LIU等[4]將含有不同比例牛奶濃縮蛋白的3D打印產品放置了4 h后，發現產品的強度和穩定性在一定范圍(15%～25%)內隨著牛奶濃縮蛋白含量的增加而增強，但是當牛奶濃縮蛋白含量超過30%時有所下降(圖1)。當油墨從噴嘴中擠出困難或黏附性不佳時，可以加入蛋黃蛋白[8]或者乳清分離蛋白[14, 16]來對油墨的流動性進行改善。例如，LIU等[14]通過對含有乳清分離蛋白、牛奶濃縮蛋白和黃原膠的混合油墨研究后發現，隨著混合油墨中乳清分離蛋白比例的增加，油墨的硬度從269.11 g顯著降低至72.38 g，黏附性從4.08 g·s顯著增加至101.94 g·s。這表明乳清分離蛋白不僅可以對油墨質地進行軟化還可以增加油墨的黏附性，有利于油墨從噴嘴擠出并形成連續沉積層。

圖1 牛奶濃縮蛋白對油墨可打印性的影響Fig.1 Effect of milk protein concentrate on printability of inks

1.2 組織框架型蛋白質

組織框架型蛋白質是指在不添加其他成分的情況下即可獨立作為打印油墨擠壓、成型的蛋白質。這類蛋白質具有較好的凝膠特性，因此可以直接形成3D打印產品的組織結構。明膠和膠原蛋白是現階段研究中發現的組織框架型蛋白質。明膠是一種非碳水化合物水凝膠，由動物皮膚、結締組織和骨骼中的膠原蛋白部分水解而成。它有良好的膨脹性和凝膠性，可容納大量水分，具有獨特的“口中融化”質地，可為消費者提供獨特的口感和風味感知[23]。COHEN等[24]的研究表明，僅使用質量分數為1%的明膠即可打印出可自撐的3D打印產品，4%的明膠打印出來的產品質地比較堅硬，口感近似巧克力或者蘑菇。組織框架型蛋白質在3D打印中除了單獨作為打印油墨外，更多的是作為主體結構物質(塑形成分)與其他原料混合制成打印油墨。CHEN等[3]研究發現，在大豆分離蛋白質中添加明膠可以顯著提高3D打印材料的硬度、彈性和咀嚼性，其值分別是對照組(未加明膠)的13.95倍、1.15倍和15.03倍；此外，SEVERINI等[12]設計了一款含有胡蘿卜、西蘭花、梨等果蔬的3D打印材料，為了使其能從噴嘴中成功擠出結構，加入了1%的魚膠原蛋白來增加油墨黏度。這說明在混合油墨中添加明膠、膠原蛋白等組織框架型蛋白質能提升打印油墨的可打印性，并保持打印產品的結構穩定。

1.3 營養補充型蛋白質

蛋白質是維持人類生命活動的基礎物質，將蛋白質應用于3D打印中可以豐富油墨的營養。大豆分離蛋白具有較高的消化利用率，牛奶蛋白具有優異的蛋白質生物價；在3D打印油墨中氨基酸組成不均勻或者缺乏蛋白質時添加大豆分離蛋白[3]或牛奶[15]可以豐富混合油墨的氨基酸組成及蛋白質含量，從而提高打印食品的營養價值。此外，一些低值但氨基酸組成平衡的蛋白質也是營養補充型蛋白質的理想來源，如昆蟲蛋白?？墒承岳ハx是一種富含蛋白和微量元素的新型食物來源，推動可食性昆蟲進入人類餐桌是解決世界糧食供應短缺的一種潛在解決方案。然而昆蟲的形態悚然，人們在食用時無法克服恐懼心理，這阻礙了其被擺上餐桌。3D打印技術能夠改變可食性昆蟲的外觀，增加其在人群中的可接受度。SEVERINI等[9]以小麥粉為結構劑，在其中加入了黃粉蟲幼蟲(蛋白質含量54.2%)，設計了一款中空的柱狀3D打印產品，這能很好地減輕食用者的心理負擔(圖2)。此外，通過對打印材料組分性質和后處理過程中尺寸的變化分析發現，黃粉蟲幼蟲不僅可以改善面團的氨基酸組成(必需氨基酸增加了8.8%)，還可以減少烘烤過程中產品的水分流失。

圖2 3D打印前后黃粉幼蟲外觀變化Fig.2 Changes in the appearance of yellow powder larvae before and after 3D printing

2 3D打印蛋白質的影響因素

2.1 打印材料流變性

3D打印技術類型多樣，最常見的有熱熔/空氣擠出，選擇性激光燒結，粘合劑噴射和噴墨打印[6]。在實際應用中，打印技術的選擇和打印材料自身特性有關。流動性好、易于凝固的打印材料(如面團、蔬菜泥)適合熱熔/空氣擠出技術，熔點較低的打印材料(糖、脂肪為主的打印基質)則更適合使用選擇性激光燒結技術[25]。蛋白質油墨具有一定的流動性，因此在目前的研究中常選用熱熔/空氣擠出技術來對蛋白質油墨進行打印。基于擠壓式的3D打印蛋白質技術效果的好壞一定程度上取決于油墨流動性是否適當，性質適當的打印材料能夠從打印噴嘴中成功擠出并以設計好的結構沉積在打印平臺上[14]。3D打印蛋白質的油墨在打印過程中是半固態的，適用于打印的油墨應該具有適當的黏度和彈性，良好的假塑性(體現在表觀黏度隨剪切速率的增加而降低)。因此打印油墨在打印過程中的流變性質是判斷其是否可用于3D打印的重要指標之一。油墨中蛋白質的性質、含量以及打印過程中的溫度都會對打印油墨的流變性造成影響。

2.2.1 蛋白質含量

蛋白質含量的高低會對打印油墨的流變性造成影響。牛奶濃縮蛋白、脫脂奶粉、明膠的加入可以增加油墨的機械強度；蛋黃蛋白、乳清分離蛋白則可以增加油墨的流動性，使混合油墨更易于從噴嘴中擠出。BORAN等[26]將明膠制成3D打印油墨，且發現油墨的強度和黏度主要受明膠濃度影響。ZHANG等[22]比較了面團中蛋白質含量(7.2%和12%)對油墨流變性質的影響，結果表明隨著蛋白質含量的增加，打印油墨的儲能模量G′和損耗模量G″均增加，在1 Hz時其復數黏度也增加，這可能是因為較高的蛋白質含量有利于連續面筋網絡的形成。LIU等[10]研究發現，在含有明膠、玉米淀粉和蔗糖的復雜混合物系統加入質量分數為5%的蛋清蛋白，可以改善打印油墨的硬度和彈性，有利于打印油墨從噴嘴中及時擠出；同時也提高了打印油墨的黏度，有助于在打印過程中保持所需的形狀。

2.2.2 蛋白質性質

蛋白質擁有高級的空間結構，例如膠原蛋白具有由3條α-鏈共價交聯的三螺旋結構。當蛋白質作為打印油墨的主要成分時，加入電解質成分、酶等外源物質或者使用微波處理等物理手段能使蛋白質性質改變，從而達到改善打印油墨的流變性質的效果。NaCl是食品體系中常見的物質，在具有高黏度的魚糜中添加1.5 g/100g的NaCl能改變魚糜漿液的流變性質(降低G′和G″)，有利于打印材料擠出，并使打印產品具有光滑的表面結構。這可能是因為NaCl導致了魚糜中肌球蛋白尾部發生變性，誘導分子間作用力和分子內作用力的重新分配，從而增加了魚糜的流動性[27]。轉谷氨酰酶作為一種食品添加劑在肉類工業中十分常見，它可以通過催化蛋白質分子間形成共價鍵來提高蛋白質基油墨的G′(增加彈性)、降低其對頻率的依賴性，從而增強油墨熱穩定性。例如，DU等[17]用明膠和大豆油制備凝膠狀乳液，并添加TG酶來提高凝膠乳液的熱穩定性。結果表明，TG酶交聯后的乳液凝膠在121 ℃下加熱20 min后仍保持良好的自支撐能力，這有助于打印出的產品在后加工過程中的結構穩定。此外，采用低功率的微波對油墨進行預處理則也可以提高打印油墨的黏度，且黏度會隨著微波功率的增大而進一步增大[28]。

2.2.3 打印溫度

溫度與打印材料的流變性質聯系尤為緊密，這在3D打印巧克力的研究中已充分體現。在3D打印蛋白質的油墨中，明膠的流變性質受溫度的影響較大。溫度決定著明膠處于溶膠的狀態還是凝膠的狀態，因此打印過程中的控制溫度對明膠產品的呈現極為重要。在低于膠凝溫度的溫度下，G′>G″，這表明該混合物表現為彈性結構主導的固體，此時的3D打印產品結構更明確，材料的擴散更少[29]。

2.2 打印機械參數

3D打印過程中的打印機械參數也會對最終產品的品質好壞造成影響。表2總結了3D打印蛋白質的機械參數。由表2可知，噴嘴移動速度的常用參數為10～70 mm/s；噴嘴直徑通常為0.84～2.00 mm；擠出速度的常用參數為0.003～0.005 mm3/s。噴嘴移動速度是打印產品輪廓并填充時噴嘴的移動速度，其快慢會對產品最終呈現造成影響[30]。打印過程中噴嘴移動速度太快，可能會導致產品擠出的長絲漿料發生拖曳而斷裂；打印過程中噴嘴移動速度太慢，可能會導致漿料因為流動不穩定而形成線圈[11](圖3)。噴嘴直徑的大小決定了打印產品的精度[31]，噴嘴直徑越小，打印樣品的細化程度越高，樣品質量也越高。例如，ANUKIRUTHIKA等[8]比較了2種規格的噴嘴直徑(0.84 mm和1.22 mm)對雞蛋清、雞蛋黃打印產品質量的影響。結果表明，使用直徑為0.84 mm噴嘴打印的產品具有更好的涂層細節和更高的精度。然而，較小的噴嘴直徑在提高打印產品的分辨率的同時會增加打印的時間和進料的壓力。因此，在實際操作時應當選擇適宜大小的噴嘴直徑才能在打印效率和產品精度之間取得良好的平衡。擠出速度通過影響蛋白質在油墨中的分布來對油墨質地造成影響。TOHIC等[32]通過比較未處理的奶酪、融化處理的奶酪和經3D打印以不同擠出速率(4 mL/min或12 mL/min)擠出的融化奶酪的激光掃面共聚焦結果發現，與未經處理的奶酪相比，融化處理和擠壓處理會破壞奶酪中蛋白質與脂肪的分布均勻性，且剪切速率越大對奶酪中蛋白質和脂肪分布的破壞越劇烈(圖4)。此外，噴嘴高度也是保證成功打印的機械指標之一，在打印時其值不應低于臨界噴嘴高度。這是因為，當噴嘴高度低于臨界噴嘴高度時，漿料會因為來不及沉積而擠壓在噴嘴與打印產品之間[33]。臨界噴嘴高度可由公式(1)計算[34]：

(1)

式中：hc是噴嘴的臨界高度，mm；Vd是擠出速度，cm3/s；Vn是噴嘴移動速度,mm/s；Dn是噴嘴直徑,mm。目前，已發表論文中對3D打印時噴嘴高度報道較少，因此無法總結出其常用的參數范圍。

表2 3D打印蛋白質過程的機械參數Table 2 The mechanical parameters of 3D printed protein.

圖3 噴嘴移動速度對打印效果的影響Fig.3 Effect of nozzle moving speed on printing result.

圖4 尼羅紅(脂質)和固綠FCF(蛋白質)溶液染色的 奶酪樣品共聚焦激光掃描顯微圖Fig.4 CLSM of cheese sample stained with Nile Red and Fast Green FCF solution

3 3D打印蛋白質技術的潛在應用領域

3.1 食品領域

蛋白質作為一種人類生存不可或缺的營養元素，是3D打印食品技術的主要打印原料之一，以蛋白質為原料的3D打印技術在食品領域有廣泛應用。使用3D打印技術打印出的食品較傳統食品有以下三點優勢:(1)3D打印可以根據不同人群的營養需求制定特定配方。幼兒時期飲食的營養均衡性對其生長發育至關重要，然而先天食物偏愛(甜味食品)導致部分幼兒對蔬果肉蛋的攝入有著排斥心理而拒絕食用，同時強迫幼兒食用反而會加重其對該食物的逆反心理，從而導致其無法獲得滿足健康生長所必需的營養素。3D打印蛋白質技術可通過改變打印油墨的配方來實現食品的私人訂制，從而改善了營養攝入不均衡的問題。(2)3D打印蛋白質技術可以提高消費者的消費體驗。老年人由于咀嚼能力下降，日常飲食以濕軟食品為主，此類食品外觀普通且缺乏多樣性，從而大大降低了老年群體的食用感官體驗。3D打印蛋白質技術可以對食品的外觀進行改良，打印出形狀豐富的食品，為咀嚼困難人群提供更加具有視覺吸引力的食品，提高其生活質量。KOUZANI等[35]使用金槍魚(蛋白質來源)、南瓜和甜菜制成3D打印油墨，打印出了適合老年人食用魚狀食物。打印出的魚狀食物相較于單一的泥狀食物，在視覺感官上得到了有效改善，從而減輕了長期食用單一流食而帶來的厭倦感；通過品嘗打印前的泥狀油墨及打印后的魚狀產品發現，打印前后的味道基本上沒有區別，這意味著3D打印并不會給食材風味帶來不良影響。(3)3D打印蛋白質技術的應用還可緩解世界蛋白質來源不足的危機[9]。通過3D打印技術改變具有豐富蛋白質的昆蟲形態，使之成為人們接受度更高的食品，是緩解世界蛋白質來源不足危機的一個方式。

3.2 組織工程領域

除了食品領域，天然可打印蛋白質在醫療領域作為生物打印材料而被廣泛應用。生物打印技術是將細胞與水凝膠混合制成打印油墨，通過3D打印機來制造出模擬組織結構的技術；與傳統的模擬組織工程技術(直接將細胞接種在生物材料表面)相比，生物打印技術不但可以為細胞提供合適的細胞外基質，促進細胞的生長轉化，還可以從微米級別上精確地控制人造器官中細胞的分布[36]。明膠、膠原蛋白等蛋白質材料是廣泛用于生物打印的天然油墨，這是因為它們既能作為細胞外基質的重要組分，又能在保持結構穩定中發揮重要作用。明膠具有良好的凝膠性能和生物相容性[37]，是一種天然衍生的水凝膠，不但可以彌補天然水凝膠可調性有限、易出現疾病轉移的缺陷，還可以解決合成水凝膠缺乏生物功能的問題[38]。膠原蛋白是動物結締組織中的主要成分之一，具有多種類型，在生物打印中應用頻率最高的是I型膠原蛋白。這是因為I型膠原蛋白具有良好的自組裝能力，能夠形成纖維狀水凝膠。然而，I型膠原蛋白在生理溫度(約37 ℃)下形成凝膠的時間較長(約30 min)，這會對打印油墨中細胞的均一性造成不良影響，因此現有報道通常將其摻入其他水凝膠中混合使用[39]。此外，純明膠在生理溫度(約37 ℃)下會形成低黏度的溶液，穩定性較差，這成為其在生物打印中應用的一個弊端。把明膠交聯后再進行生物打印可以提高油墨的穩定性[40]。目前常用的交聯方法有化學交聯、酶交聯和光交聯。WANG等[19]以肝細胞和明膠水凝膠作為打印油墨，通過在戊二醛溶液中化學交聯后，打印出了一個由38層肝細胞和明膠混合物疊加而成的高空間結構。經體外培養45 d后，打印出的3D結構仍然非常完整且嵌入支架中的肝細胞存活率高達90%，這說明經交聯后3D打印出來的類肝臟結構體機構穩定，且能在較長時間內維持肝臟的功能。RAVEENDRAN等[20]將明膠與甲基丙烯酸基團官能化后，使用細胞相容性光引發劑來促進其快速光交聯，并與牙周膜細胞混合制成打印墨水進行生物打印，結果表明打印得到組織能在生理溫度(約37 ℃)下保持穩定，并且組織中的牙周膜細胞在14 d內有較高的生長水平。

4 展望

就現階段對3D打印蛋白質的研究現狀與進展來看，仍需要從以下幾個方面對其進行深入研究。

(1)3D打印蛋白質技術對打印產品質構特性的可調控研究。食品合成生物學是目前食品領域的前沿技術，3D打印技術作為一種重組工具，是將食品組分重組為食品的重要環節。不同的食品擁有不同的質構特性，尤其是蛋白質類食品。然而，目前3D打印蛋白質技術調控食品質構特性的能力不足，僅有通過調整打印參數來優化產品精細化程度的報道。因此可以從噴嘴形狀、噴射力學等方面對3D打印設備進行設計，從而充分調控蛋白質基3D打印產品的質構特性(如硬度、彈性)，這將是蛋白質基油墨相較于其他成分應用于3D打印中的一大優勢。

(2)蛋白質與其他大分子物質的界面互作與油墨適印性的研究。蛋白質具有兩親性(親水親油)，因此能自發轉移至油-水界面形成吸附層，以維持界面的穩定；兩親性質賦予了蛋白質良好的乳化特性。如研究所知，以蛋白質為基質的乳液凝膠是3D打印蛋白質油墨的良好來源，目前已有將乳液凝膠應用于3D打印中的相關報道。研究發現，蛋白質與其他大分子材料間(如多糖)的交互作用(如形成氫鍵、離子鍵)可以有效提高乳液的穩定性，而3D打印油墨的穩定性是評價油墨適印性的重要指標之一，目前使用蛋白質與其他大分子物質界面互作以提高油墨穩定性的研究尚未見報道。

(3)建立一種通用的能夠評價蛋白質基油墨是否適用于3D打印的評價方法。流變特性(G′、G″)和質構特性(硬度)是現階段研究中常用的評價蛋白質基油墨是否適用于3D打印的指標。然而，這種評價方法是非常局限的，這是因為能夠從噴嘴擠出且自撐的打印油墨A的G′、G″和硬度值的范圍僅僅適用于打印油墨A本身。打印油墨B在這個區間范圍的3D打印效果往往是不盡人意的；此外，能夠從噴嘴擠出且自撐的打印油墨A和打印油墨B的G′、G″和硬度值范圍甚至可能相差幾個數量級。因此，未來需要尋找一種可以概括多種蛋白質基油墨可打印性的評價方法。目前，已出現用相位角及弛豫指數(相位角在3°～15°且弛豫指數在0.03～0.13)來判斷水凝膠適印性的相關報道，這為建立蛋白質基油墨適印性的評價方法提供了良好的思路。

(4)升級打印機功能，賦能3D打印蛋白質技術市場化、成熟化發展。隨著現代社會生活節奏的加快及生活水平的提高，方便快捷且新穎的烹飪方式更能吸引消費者的目光。目前蛋白基油墨在3D打印方面的研究更多的是利用蛋白質油墨自身的流變學特性，因此打印后的產品需要進行熱處理加工等一系列繁瑣過程，過于復雜的加工過程不符合當代消費者的生活習慣。其次，現有報道中通過3D打印技術打印出的產品完全可以通過模具積壓生產來取代。這成為了限制3D打印技術在消費市場中推廣流通的弊端之一。開發一款兼具擠壓成型及熟化加工一體化的3D打印機設備將有效解決這一問題，因此升級3D打印機功能是將科研成果轉化為實踐應用的有效手段之一。此外，很多蛋白具有熱處理后變性成形的特性(如蛋清蛋白)，目前大多數食品3D打印裝備具有噴嘴加熱功能，但如果在蛋白質材料打印時采用，非常容易堵塞噴嘴。因此，將瞬時加熱技術應用于3D打印裝備改進中，可以更好地促進蛋白質在3D打印領域中應用。

(5)4D打印蛋白質技術的開發。4D打印技術是指隨著時間的推移，打印產品可以通過溫度、濕度、酸堿環境等外界因素的變化來對感官特性和功能特性進行改變。4D打印技術是3D打印技術基礎上的發展，相較于3D打印技術增加了時間維度。目前已有將花青素應用于4D打印食品中的研究，使得打印出的產品可以根據時間的推移而發生顏色變化，這極大地增強了消費者的感官體驗。對溫度、酸堿環境敏感的蛋白質材料(如明膠)是潛在的打印油墨來源，在4D打印技術上具有一定的應用潛力，有待科研人員進一步探索，以期蛋白質材料在增材制造市場上更廣泛的應用。