川產竹葉花椒揮發油中12種揮發性成分的測定與比較

楊森，何晗，易達，王福，劉友平，陳林*，陳鴻平*

1(成都中醫藥大學 藥學院，四川 成都，611137)2(四川省南充市食品藥品檢驗所，四川 南充，637002)

竹葉花椒(ZanthoxylumarmatumDC.)為蕓香科花椒屬(ZanthoxylumL.)植物的成熟果實，主產于四川盆地及其周邊山地和重慶江津一帶[1-2]。竹葉花椒因其清香麻鮮的味道和翠綠的色澤受到廣大消費者的喜愛，近年來其近成熟的干燥果實常作為“青花椒”商品而備受關注[3]。

揮發油是竹葉花椒香味的主要表征成分，也是其品質評價的主要指標，主要由烯類、醇類、酮類、醛類等成分組成[4]。目前對花椒揮發油的研究主要集中在化學成分分析和藥理活性的研究上，如對不同檢測方式、不同提取方式、不同炮制方式、不同品種、不同產地的花椒揮發油中的揮發性成分的組成及相對含量的差異進行比較[5-11]，結果表明不同花椒揮發油揮發性成分差異較大，但主要以烯類、醇類成分為主；對花椒揮發油的抑菌、抗炎鎮痛、促透皮吸收等藥理活性進行研究[12-14]。但目前關于竹葉花椒揮發油中揮發性成分的定量分析研究報道較少，鄧凱文等[15]、司昕蕾等[16]僅對花椒揮發油中主要成分芳樟醇、檸檬烯的含量進行了測定，現行的國家食品標準GB/T 30391—2013、四川地方標準SCYCBZ 2019-001等也僅對花椒揮發油的含量做出了要求(≥4%)，對具體成分含量并未做出規定。

鑒于揮發油是竹葉花椒的重要質量評價指標，在前期系統調研的基礎上，本文選取了已報道竹葉花椒揮發油中含量較高的12種代表性成分(α-蒎烯、檜烯、β-蒎烯、月桂烯、D-檸檬烯、γ-松油烯、萜品油烯、芳樟醇、α-松油醇、乙酸芳樟酯、α-石竹烯、β-石竹烯)，利用氣相色譜-質譜/選擇離子監測法(gas chromatography-mass spectrometry/selected ion monitor，GC-MS/SIM)建立了竹葉花椒揮發油中多種揮發性成分定量檢測的方法，并測定了22個產地竹葉花椒揮發油中12種揮發性成分的含量，以期為竹葉花椒質量評價及其標準提供參考[17-18]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水楊酸甲酯(AF20070751)、1-壬醇(AF20122111)、環己酮(AF20122116)、萜品油烯(AF20122117)、α-石竹烯(AF20122010)、β-石竹烯(AF20032353)、α-蒎烯(AF9091602)、月桂烯(AF20122051)、L-α-松油醇(AF20081520)、D-檸檬烯(AF20051051)、芳樟醇(AF20072551)、檜烯(AF201220)、β-蒎烯(AF20122009)、萜品醇(AF20122006)、乙酸芳樟酯(AF20122007)，均為色譜純，純度98%，成都克洛瑪生物科技有限公司提供；正己烷為色譜純，成都科隆化學試劑有限公司。

竹葉花椒樣品通過委托不同產地商家代為購買，并在實驗室除去多余的雜質和種子，經成都中醫藥大學陳鴻平教授鑒定樣品來源均為蕓香科花椒屬植物竹葉花椒干燥成熟果皮，樣品信息見表1。

1.2 儀器與設備

77890Aglient GC型氣相色譜儀、5975 MSD型質譜儀、質譜檢索數據庫NIST 14、HP-5MS 5%苯基甲基硅氧烷氣相色譜柱，美國Aglient公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 揮發油提取[19]

取竹葉花椒粉末樣品，粉碎過2號篩，混勻，每組15 g，稱定，平行3次，加水200 mL，振搖混合均勻，浸泡2 h，按《中國藥典》2020版四部(2204)揮發油測定甲法蒸餾得到不同產地竹葉花椒揮發油。

1.3.2 溶液的制備

對照品溶液的制備：精密稱定α-蒎烯、檜烯、β-蒎烯、月桂烯、D-檸檬烯、γ-松油烯、萜品油烯、芳樟醇、α-松油醇、乙酸芳樟酯、α-石竹烯、β-石竹烯，置于10 mL容量瓶中，用正己烷溶解并定容至刻度，得對照品溶液，質量濃度分別為1.263、1.340、1.249、1.216、7.826、0.699、1.035、9.430、0.279、0.748、0.905、2.943 mg/mL。

內標溶液配制：精密量取稱取1-壬醇，加入正己烷稀釋并定容至刻度，搖勻，得質量濃度為1.288 mg/mL的內標溶液。

供試品溶液的制備：取不同產地竹葉花椒揮發油20 μL定容至25 mL，取1 mL至5 mL容量瓶中，加入30 μL 內標溶液，定容，過0.22 μm的微孔濾膜即得。

1.3.3 GC-MS分析條件

氣相色譜條件：載氣為高純氦氣；體積流量1 mL/min，進樣量1 μL，進樣口溫度230 ℃，分流比30∶1。升溫程序：60 ℃保持1 min，以1 ℃/min升溫至73 ℃，再以5 ℃/min升溫至165 ℃，最后以20 ℃/min 升溫至280 ℃，保持5 min。

質譜條件：電離方式為電子轟擊離子源(electron impact ion source，EI)，電子轟擊能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，溶劑延遲9 min；定性采用全掃描，掃描范圍40～500，駐留時間0.2 s。定量采用選擇離子掃描模式(SIM)，SIM參數見表2。

表2 選擇離子檢測模式參數Table 2 Selected ion detection mode parameters

2 結果與分析

2.1 色譜分離結果

12種揮發性成分在此條件下分離效果如圖1所示。由圖1可知在該條件下12種揮發性成分的分離效果較好。

1-α-蒎烯；2-檜烯；3-β-蒎烯；4-月桂烯；5-D-檸檬烯； 6-γ-松油烯；7-萜品油烯；8-芳樟醇；9-α-松油醇；10-乙酸方樟酯； 11-α-石竹烯；12-β-石竹烯(下同)圖1 十二種揮發性成分總離子流圖Fig.1 Total ion current diagram of 12 volatile components

2.2 內標物的篩選

選擇1種竹葉花椒揮發油中不含有且不產生，同時與竹葉花椒中揮發性成分性質相似的揮發性物質，沸點相近，揮發后性質穩定，保證其在色譜柱上能與其他揮發性成分分開。本文比較了環己酮、1-壬醇、水楊酸甲酯3種物質，由圖2可知其保留時間分別為8.014、22.971、23.903 min，環己酮出峰時間早于其他揮發性成分，而水楊酸甲酯的保留時間與α-松油醇的保留時間(23.759 min)相近，分離效果不佳，故選擇1-壬醇作為內標。

2.3 定量離子對的選擇

在上述色譜和質譜條件下不同揮發性成分及內標物的離子選擇結果見表2。選擇其中豐度較高的離子作為定量和定型離子。

圖2 內標物考察結果Fig.2 Results of investigation of internal standards

2.4 線性范圍、檢出限、定量限

精密量取混合對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于5 mL容量瓶中，加入內標溶液30 μL，定容混勻，即得不同質量濃度的混合對照品質量溶液。以內標物質量與對照品響應值之比作為縱坐標，以對照品濃度與內標物濃度之比作為橫坐標，進行標準曲線繪制，結果見表3。以目標化合物色譜峰信噪比(S/N)大于3的質量濃度確定檢出限，信噪比(S/N)大于10的質量濃度確定為定量限。不同揮發性成分的檢出限和定量限如表3所示。

表3 線性關系及回收率考察結果Table 3 Results of linear relationship investigation

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度

取同一對照品溶液，按1.3.3檢測條件重復進樣6次，計算各揮發性成分峰面積與內標物的比值，測得12種揮發性成分的相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)值分別為4.79%、5.25%、4.98%、5.28%、5.81%、5.43%、5.58%、1.43%、4.76%、5.89%、5.03%、4.76%，表明該儀器精密度良好。

2.5.2 穩定性

取竹葉花椒揮發油(S20)，按1.3.2制備加標試樣，分別于0、8、14、18、20、24 h進樣，測定并記錄各成分與內標物峰面積的比值，測得12種揮發性成分的RSD值分別為1.66%、3.95%、3.79%、4.41%、4.43%、3.31%、2.68%、2.93%、3.92%、3.93%、5.62%、3.69%，表明該供試品溶液在24 h內穩定。

2.5.3 重復性

取樣品S20揮發油溶液，按“1.3.2”項下方法制備平行供試品溶液6份，按照“1.3.2”項下條件進樣，計算各揮發性成分峰面積與內標物的比值，測得12種揮發性成分的RSD值分別為4.01%、3.21%、5.00%、3.12%、5.28%、3.44%、4.06%、4.74%、3.98%、2.89%、2.56%、2.91%，表明方法重復性良好。

2.5.4 加標回收率

取竹葉花椒揮發油(S20)，精密加入α-蒎烯、檜烯、β-蒎烯、月桂烯、D-檸檬烯、γ-松油烯、萜品油烯、芳樟醇、α-松油醇、乙酸芳樟酯、α-石竹烯、β-石竹烯對照品，按照1.3.3的條件進行測量,測定結果見表3。RSD在0.007%～5.862%，回收率在98.333%～105.487%，表明該方法準確度較好。

2.6 實際樣品的測定

采用本方法對不同產地的22批竹葉花椒中的揮發油進行了提取，并對其中12種揮發性成分進行了定量分析，測定結果見表4。所測定的22個產地的樣品中，均含有以上12種揮發性成分，但含量差異較大，不同產地竹葉花椒中12種揮發性成分的含量范圍由高到低依次為：芳樟醇(293.938～413.975 mg/mL)、檜烯(33.858～123.442 mg/mL)、D-檸檬烯(28.832～57.988 mg/mL)、月桂烯(13.570～35.067 mg/mL)、乙酸芳樟酯(2.540～24.212 mg/mL)、α-石竹烯(9.115～15.085 mg/mL)、β-石竹烯(6.111～16.675 mg/mL)、α-松油醇(3.058～6.088 mg/mL)、γ-松油烯(1.794～3.515 mg/mL)、α-蒎烯(0.851～3.720 mg/mL)、萜品油烯(0.807～1.421 mg/mL)、β-蒎烯(0.178～0.608 mg/mL)。

2.7 聚類分析

以22批竹葉花椒中12種揮發性成分的含量為數據源，以平方歐式距離進行層次聚類分析,聚類結果見圖3。當歐式距離為15時，22批竹葉花椒被聚成三類，其中樣品S17、S19、S16、S11聚為一類，S3、S20聚為一類，其余樣品聚為一類。整體來看，竹葉花椒揮發性成分與地域關聯性不強，如南充市營山縣和儀隴縣，巴中市平昌縣和通江縣均被聚為不同的類別，這可能是由于竹葉花椒中揮發性成分不穩定，且不同的產地加工方式、氣候條件、栽培品種等多因素導致不同產地竹葉花椒揮發性成分差異較大，從而導致其不能很好地聚類[20-22]。

圖3 不同產地竹葉花椒揮發油聚類分析結果Fig.3 Cluster analysis results of volatile oil of Zanthoxylum armatum DC.from different origin

表4 樣品測定結果(n=3) 單位:mg/mL

3 結論與討論

本實驗利用GC-MS/SIM技術建立了同時測定竹葉花椒中12種主要揮發性成分含量的方法，在選擇離子檢測方式下，僅對待測組分進行定性和定量，減少了雜質峰的干擾，大大提高了檢測的靈敏度，該方法所建立的標準曲線線性相關性好、選擇性高、專屬性強、準確度高、重復性好，可作為竹葉花椒精油質量控制的檢測方法[23-24]。

對四川境內22個產地的竹葉花椒揮發油中12種揮發性成分分析發現，不同產地竹葉花椒揮發油中揮發性成分均以芳樟醇、檸檬烯、檜烯為主，但含量差異較大，其揮發性成分無明顯的地域差異，這可能是由于加工方式、栽培品種、產地等多種因素造成的。揮發性成分的差異，常會引起藥理活性的改變，而本研究采用GC-MS/SIM對竹葉花椒中常報道的12種揮發性成分進行了定量，也為后續揮發油的選擇及藥理作用的研究提供了實驗依據，同時為竹葉花椒的質量控制提供了參考。