利用環介導等溫擴增技術快速檢測金槍魚制品中的鰹魚成分

許文杰，李秋萍，崔曉文，操敏，李壹，熊曉輝,2，熊雄*

1(南京工業大學 食品與輕工學院，江蘇 南京，211816)2(江蘇省食品安全快速檢測公共技術服務中心，江蘇 南京，211816)

金槍魚族是屬于硬骨魚綱鱸形目鯖科的魚類，包含細鰹屬(Allothunnus)、舵鰹屬(Auxis)、巴鰹屬(Euthynnus)、鰹屬(Katsuwonus)、金槍魚屬(Thunnus)等5屬15種金槍魚[1]。鰹魚(Katsuwonuspelamis)是鰹屬中唯一品種，在金槍魚漁業中有著舉足輕重的地位。2018年，鰹魚捕撈量為316萬 t，占金槍魚捕撈總量的56%以上[2]。

金槍魚肉質鮮美，具有高蛋白、低脂肪等特點，并且富含豐富的二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)與二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)等不飽和脂肪酸，是最受消費者歡迎的鯖科魚類品種之一。然而，金槍魚較少以鮮活的形式進行出售，通常被加工成生魚片、罐頭、肉松等制品。由于加工破壞了其外形特征，傳統的形態特征鑒別法已經不能滿足金槍魚的物種鑒別。在這種情況下，一些不法商販為牟取暴利，在金槍魚及其制品的貿易過程中摻假、造假，以次充好的現象時有發生。安麗艷等[3]采用PCR測序技術鑒定金槍魚罐頭中金槍魚品種，在17個市售樣品中，發現58.8%來源于價格低廉的鰹魚。SOTELO等[4]對6個歐洲國家的545份金槍魚(新鮮、冷凍和罐頭產品)進行調查，發現總體標簽錯誤率為6.79%，新鮮和冷凍產品為6.70%，罐頭產品為7.84%。金槍魚市場魚目混雜，標示不清，水產品的摻假行為在媒體中頻頻曝光，引起了消費者的恐慌。因此，為了保護消費者經濟利益、維護消費者的合法權益，急需一種靈敏、特異、快速的金槍魚及其制品的鑒定方法。

基于DNA的檢測技術具有靈敏度高、特異性好等優點，已經被廣泛運用于水產品檢測[5-7]。目前，已經報道的鑒定方法有DNA條形碼法[8]、核苷酸測序法[3]、實時熒光定量PCR法[9]、PCR限制性片段長度多態性法[10-11]、多重PCR瓊脂糖電泳法[12]。其中，多重PCR瓊脂糖電泳法靈敏度較低，近物種鑒定易出現假陽性；DNA條形碼法需要測序，鑒定周期長。此外，DNA條形碼法還存在依賴參考的數據庫建設不夠完善、核內DNA條形碼和混合物種樣品單一條形碼獲取困難等不確定因素。但至今為止，采用環介導恒溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)檢測金槍魚的研究報道比較少見。

LAMP技術是NOTOMI等[13]于2000年提出的一種核酸擴增技術，該技術依賴Bst DNA聚合酶在恒溫條件下實現靶基因的自循環鏈置換合成反應，引物能識別基因的6個或8個獨立區域，特異性較PCR大大提高。另外，反應的溫度處于恒溫條件(60～65 ℃)，普通水浴鍋就可以滿足擴增的需求，節省了檢測費用。檢測結果可以通過可視化判別，在擴增產物中加入熒光染料SYBR Green I，產物結合染料后發出綠色熒光。目前已有LAMP技術應用于食源性致病菌、轉基因成分、過敏源成分[14-15]、動物源成分[19-20]等檢測方面的研究。本研究以鰹魚的線粒體Cytb基因為靶基因，設計LAMP反應特異性引物，構建LAMP反應體系，建立一種鰹魚的特異性快速檢測技術，為金槍魚制品的摻假鑒偽提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品的采集

22種水產品標準品來自本課題組前期研究，包括Katsuwonuspelamis(MK843764)、Thunnusobesus(MN893173)、T.albocaves(MN893174)、T.alalunga(MN893175)、Scomberniphonius(MN879568)、Scomberspp(MK843721)、Scomberscombrus(MN893176)、Oyprinuscarpio(MK843655)、Collaectenes(MK84666)、Larimichrhyscrocea(MK843674)、Lateolabraxjaponicus(MK843686)、Odontobutispotamophila(MK843730)、Patagonotothenramsayt(MK843753)、Alabtrosstdpecoralls(MK843767)、Pangashushypophthalms(MK843766)、Micropterussalmoides(MK843768)、Clenopharyngodonidella(MK843773)、LophiusHitulon(MN850429)、Oncorhymnchusmykiss(MN850431)、Carassiusauratus(MK843660)、Mugilcephalus(MN893207)、S.salar(MN850430)。22種樣品均進行形態學鑒定和DNA條形碼鑒定，且標準品的DNA條形碼序列已提交至GenBank，并獲得登錄號(已備注在對應物種的括號內)。

此外，2019年11月～12月，從市場共采集39份預包裝金槍魚產品(表1)，包括19份肉松產品(編號為XWJ1-XWJ19)和20份罐裝制品(編號為XWJ20-XWJ39)。所有產品抵達實驗室后需進行拍照和標記，并記錄好產品標簽上的信息。當產品包裝內有多個獨立小包裝時，每個小包裝需單獨取樣，共計取樣59份(表1)，樣品于-18 ℃保存備用。

1.1.2 試劑

DP304細胞/血液/組織基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；6×Loading Buffer、dNTP Mix，寶生物工程(大連)有限公司；等溫擴增混合液、2×Taq PCR Master Mix、引物合成，上海生工生物工程股份有限公司；Bst DNA聚合酶大片段、MgSO4溶液、10×ThermoPol緩沖液，美國New England Biolabs公司；SYBR Green I染料(10 000×)，北京索萊寶科技有限公司。

表1 市售樣品的采集與鑒定結果Table 1 Collection and identification results of municipal samples

1.2 儀器與設備

BioPhotometer D30核酸蛋白測定儀，德國艾本德股份有限公司；1-14k臺式小型離心機，德國Sigma公司；MS-100恒溫混勻儀，杭州奧盛儀器有限公司；Gentier 96全自動醫用PCR分析系統，西安天隆科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA提取

按照DNA提取試劑盒說明書對市售樣品的DNA進行提取，取50 mg樣品于1.5 mL離心管中，先加入200 μL Buffer GA，渦旋振蕩15 s；再加20 μL蛋白酶K(20 mg/mL)溶液，渦旋混勻后將其置于恒溫混勻器中1 500 r/min 56 ℃加熱45 min。最后，加入200 μL Buffer GB，充分顛倒混勻后置于恒溫混勻器中1 500 r/min 70 ℃加熱10 min。將所得混合物轉移至吸附柱CB3中，依次加入500 μL Buffer GD和600 μL漂洗液PW，混勻后均以12 000 r/min離心30 s，最后，向吸附膜的中間懸空滴加100 μL洗脫液TE。

DNA的質量檢測：采用BioPhotometer D30核酸蛋白測定儀分別測定DNA在230、260和280 nm的吸光值，計算A260/A280和A260/A230值，同時測定DNA濃度。對符合純度要求的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測其完整性，純度和完整性均符合要求的DNA置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.3.2 引物的設計

從GeneBank數據庫下載鰹魚(JN086155、KJ617258、EF392591、EF439208、DQ080321)的基因序列信息。并使用BioEdit軟件進行序列比對，篩選出種間差異比較大的Cytb序列作為檢測基因，此外，下載非目標物種，長鰭金槍魚(AB101291)、黃鰭金槍魚(JN086153)、馬蘇金槍魚(KF925362)、大眼金槍魚(GU256525)、藍鰭金槍魚(KF906720)等的Cytb基因序列，確保鰹魚和非目標物種之間的錯配，以保證引物的特異性。根據LAMP引物設計原則，利用在線PrimerExplorerV4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設計LAMP引物，包括外引物(F3、B3)、內引物(FIP、BIP)，引物則委托上海生工生物有限公司合成，序列見表2。

表2 本研究所用引物Table 2 The sequence of primers

1.3.3 LAMP 反應體系建立及條件優化

LAMP反應體系25 μL，含1.4 mmol/L dNTP Mix、1 μL Bst DNA 聚合酶、6 mmol/L MgSO4、2.5 μL 10×ThermoPol緩沖液、1 μL 5×SYBR Green Ⅰ、上游外引物(F3)0.2 μmol/L、下游外引物(B3)0.2 μmol/L、上游內引物(FIP)1.6 μmol/L、下游內引物(BIP)1.6 μmol/L、模板DNA 1 μL，剩下用無菌水補足至25 μL。采用恒溫實時熒光法檢測，將混合物置于65 ℃恒溫反應60 min，最后在80 ℃下10 min結束反應。也可通過向LAMP產物中加入1 μL稀釋倍數為100的 SYBR Green I染料肉眼觀察擴增情況，在紫外燈下，顏色變綠表明發生了擴增，橙色表明未發生擴增。

對該LAMP反應體系中的Mg2+濃度、外引物、內引物、dNTP Mix、10×ThermoPol緩沖液等因素進行優化，確定最終的最優反應體系。

1.3.4 PCR擴增

采用DNA條形碼通用引物(表2)擴增市售DNA樣品，采用25 μL的PCR體系，其中2×Taq PCR Master Mix體系預混液12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，加無菌水補足至25 μL。PCR擴增條件為：94 ℃預變性3 min；95 ℃ 變性30 s，53 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。反應結束后，以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

1.3.5 市售樣品檢測

利用試驗建立的LAMP方法進行市售樣品的檢測，并與DNA條形碼檢測所得數據進行對比，驗證其方法的準確性。

2 結果與分析

2.1 LAMP試驗條件優化結果

2.1.1 內外引物濃度比的優化

選取外引物與內引物濃度比梯度依次為1∶4、1∶6、1∶8、和1∶10分別進行LAMP反應，觀察陽性反應出現的快慢，從而確認引物濃度比對擴增反應的影響，以此結果確定最佳引物濃度比。由圖1可知，試驗選用1∶8引物濃度比擴增效果較好。

圖1 內外引物濃度比的優化Fig.1 Optimization of primer concentration ratio inside and outside

2.1.2 Mg2+濃度的優化

在最佳的引物濃度比的反應體系下，選擇優化Mg2+濃度，Mg2+是較為重要的試劑之一，能影響Bst DNA聚合酶的活性，反應過程中起到降低反應所需要的活化能的作用。選取Mg2+濃度梯度依次為0、2、4和6 mmol/L分別進行LAMP反應。由圖2可知，在檢測濃度范圍內隨Mg2+濃度的升高，促進了反應的進行，當達到6 mmol/L濃度時，最利于反應的進行。

圖2 Mg2+濃度的優化Fig.2 Mg2+ optimization of concentration

2.1.3 dNTP Mix濃度的優化

dNTP是LAMP擴增反應的原料，dNTP Mix濃度分別為1.0、1.2、1.4和1.6 mmol/L進行擴增反應。由圖3可知，當dNTP Mix濃度為1.6 mmol/L為最適濃度。

圖3 dNTP Mix濃度的優化Fig.3 dNTP Mix concentration optimization

2.1.4 10×ThermoPol緩沖液濃度的優化

10×ThermoPol緩沖液體系添加量梯度為0.5、1.5、2.5和3.5 μL，其他條件下相同。由圖4可以看出，在檢測濃度范圍內隨濃度的升高，促進了反應的進行。當添加量為3.5 μL時，最利于反應的進行。

圖4 10×ThermoPol緩沖液濃度的優化Fig.4 10×ThermoPol optimization of buffer concentration

2.2 特異性試驗結果

以鰹魚和其他22個非目標物種的DNA為模板，進行LAMP擴增，驗證引物的特異性。擴增產物采用實時熒光法進行檢測。如圖5所示，空白對照和對照樣品均未發生擴增，以鰹魚DNA為模板的試驗組出現擴增，表明該體系具有良好的特異性。

圖5 特異性檢測Fig.5 Specific detection

2.3 靈敏度試驗分析

將鰹魚的基因組DNA進行倍比稀釋，質量濃度設定為50、5、0.5、0.05 ng/μL。作為反應模板進行擴增，確定方法的靈敏度。如圖6所示，該試驗所建立的LAMP體系的靈敏度為0.05 ng/μL。

圖6 靈敏度檢測Fig.6 Sensitivity detection

2.4 市售樣品檢測結果

為了評價所建立LAMP方法的適用性和可行性，本研究采集了59份市售樣品進行了鑒定(圖7、圖8)。檢測結果通過擴增曲線和可視化2種方式進行判別，觀察反應產物在紫外燈下是否有熒光產生。結果顯示，肉松制品鑒定結果不含目標成分，罐頭制品中6個樣本鑒定結果為鰹魚，其余樣本均為非目標物種。由此可得，LAMP鑒定結果與DNA條形碼鑒定結果一致。

圖7 市售樣品鑒定Fig.7 Sample identification

a-肉松制品；b-罐頭制品圖8 市售樣品可視化結果Fig.8 Visual results of marketed samples 注：(-)：無菌水；(+)：陽性對照

2.5 討論

在物種屬性鑒別領域，DNA條形碼技術是一種較為成熟的分子檢測技術。其理論依據是使用一段標準DNA片段，通過測序獲得樣品的線粒體序列，達到物種鑒定的目的。但是對于深加工制品，由于含有多種混合DNA，而檢測用引物是通用引物，存在極大的漏檢可能性。

LAMP技術目前在魚類物種鑒定中已廣泛使用，而建立高效快速的LAMP體系的基礎是特異性引物的設計。常用于魚類物種鑒定中的目的基因有COⅠ基因、16S rRNA基因、Cytb基因和12S rRNA基因。通過大量序列進行比對，根據相互間的遺傳距離，證實了Cytb基因作為目的基因的可行性。

傳統的LAMP法仍存在一些不足。濁度法檢測需要積累大量的擴增子，當低拷貝的模板存在時焦磷酸鎂沉淀產生較少，肉眼判斷困難；鈣黃綠素法引入的Mn2+增加了Bst聚合酶錯配的機率，且鈣黃綠素的熒光背景降低了檢測的靈敏度；可視化LAMP熒光染料SYBR GreenⅠ在水溶液中本身不發光，DNA存在時熒光顯著增強。該方法直接通過可視化比色判定檢測結果，具有快速、直觀、低成本等優點。

3 結論

本研究建立了基于Cytb基因的鰹魚LAMP檢測方法，建立的方法具有特異性強、快速的優點。在基因組DNA水平為0.05 ng/μL時，即可檢出。同時將LAMP擴增技術與熒光染料相結合，即添加指示劑實現可視化檢測結果。與DNA條形碼鑒定方法相比，該方法不需要復雜的熱循環控溫儀器，同時也提高了檢測效率降低了檢測成本，適用于大規模樣品的初篩，為監管機構快速檢測金槍魚制品的物種提供技術支持。