益生菌附屬發酵劑對切達干酪質構、游離氨基酸和短鏈脂肪酸的影響

王超，高磊，趙子健，趙玉娟，楊舸，牛春華，李盛鈺*

1(吉林省農業科學院 農產品加工研究所，國家乳品加工技術研發分中心，吉林 長春，130033)2(大連工業大學 生物工程學院， 遼寧 大連，116034)

干酪的微生物生態系統組成主要由干酪加工過程中添加的中溫乳球菌(如Lactococcuslactissubsp.Cremoris，Lactococcuslactissubsp.lactis)為主，或以添加非發酵劑乳酸菌(non-starter lactic acid bacteria，NSLAB)為輔[1-2]，如乳桿菌(Lactobacillus)、片球菌(Pediococcus)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)等，這些附屬發酵菌株單獨或聯合使用，有助于促進干酪中蛋白和脂肪的酶解，產生游離氨基酸、脂肪酸和風味物質，可以改善干酪的口感、風味、質構和營養特性[3-8]。

益生菌干酪是指在干酪加工過程中添加益生菌為附屬發酵劑制成的干酪產品[9-10]。益生菌賦予了干酪新的功能，提升干酪品質和安全性并對健康有促進作用。同時，干酪的高脂肪、高蛋白、低含氧量等理化性質是附屬發酵劑益生菌的優良載體[11]，有利于菌株存活。因此，這類益生菌與干酪完美結合的新型干酪產品成為當前功能食品領域的研究熱點。目前，商業上應用的附屬發酵劑主要為乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的菌株，其他功能性益生菌株應用于干酪的研究較少。篩選具有優良發酵特性和功能作用的益生菌附屬發酵劑，對于開發益生菌干酪新產品具有十分重要的意義。本研究團隊前期篩選評價獲得2株功能益生菌新菌株，其中1株為降血脂和改善脂肪肝作用的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)NA136[12-13]，另1株為具有預防和治療早期動脈粥樣硬化的乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)AS185[14]，且2株菌具有較好的耐受、黏附、產酸和生長特性，本研究以這2株益生菌為附屬發酵劑加工益生菌切達干酪，評價益生菌對干酪品質提升的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌(L.plantarum)NA136由本實驗室分離自延吉農家酸菜，現保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC NO:M 2018112)；乳酸片球菌(P.acidilactici)AS185由本實驗室分離自延吉農家黃豆醬，現保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC NO:M 2018114)；商品發酵劑R707(由乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcuslactis.subsp.lactis)和乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcuslactis.subsp.cremoris)組成)、凝乳酶(CHY-MAX Power NB)，丹麥科漢森公司。

1.2 儀器與設備

MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋，日本Sanyo公司；BCN-1360B無菌超凈工作臺，哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；HZQ-Q電熱恒溫培養箱，上海一恒實驗設備有限公司；Sorvall Evolotion RC高速冷凍離心機，美國Thermo公司；Lacto Star乳成分含量分析儀，德國Gerber公司；HYCV-407干酪槽、HYPC-4壓榨機，黑龍江赫益乳業科技有限公司；SHP-60勻漿機，上海科學技術大學機電廠；Testo205 pH計，德國Testo公司；TA.XT plus物性分析儀，英國Stable Micro Systems公司；1260高效液相色譜儀、7890B-7000D氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司。

1.3 培養基

改良MRS培養基(g/L)：蛋白胨 10.0，牛肉浸粉 10.0，酵母浸粉 2.0，磷酸氫二鉀 2.0，無水乙酸鈉5.0，枸櫞酸三銨 2.0，硫酸鎂 0.2，硫酸錳 0.05，吐溫-80 1.0，葡萄糖 20.0，碳酸鈣 5.0，瓊脂粉 20.0，pH=6.0～6.5，115 ℃高壓滅菌20 min。

改良M17培養基(g/L)：胰蛋白胨 10.0，牛肉膏 5.0，酵母膏 2.5，磷酸甘油二鈉 10.0，硫酸鎂 0.25，異抗壞血酸鈉 0.5，瓊脂粉 20.0，pH=7.1～7.2，115 ℃高壓滅菌20 min。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌懸液制備

植物乳桿菌NA136和乳酸片球菌AS185的凍存菌種經連續傳代活化后，分別接種于改良MRS及M17液體培養基中，37 ℃靜置培養16 h后，離心(5 000 r/min，4 ℃，10 min)，去上清液，用PBS溶液(pH=7.2)洗滌菌體沉淀，再重懸于PBS溶液中，調整菌液濃度為1.0×1010CFU/mL，置于4 ℃冰箱保存備用。

1.4.2 切達干酪制作與分組

切達干酪加工工藝如下：

原料乳→過濾→巴氏殺菌(63 ℃，30 min)→冷卻(37 ℃)→接種商品發酵劑和益生菌(NA136或AS185)→發酵(37 ℃，60 min)→添加氯化鈣(0.1 g/L)→添加凝乳酶(0.014 g/L)→凝乳(37 ℃，35～50 min)→切割凝塊→攪拌、熱燙(30 min內升溫至42 ℃)→排乳清→堆釀→破碎凝塊→拌鹽(2%，質量分數)→預壓榨(0.2 MPa，1.5 h)→壓榨(0.5 MPa，20 h)→真空包裝→貯存成熟(8～12 ℃，相對濕度70%)。

干酪制作分組：分為對照組、NA136組和AS185組，對照組僅接種商品發酵劑(R707 0.03 g/L)，NA136組和AS185組接種商品發酵劑的同時分別添加對應的菌懸液，并使其在原料乳中的終濃度達到1.0×108CFU/mL。

1.4.3 理化指標測定

蛋白質含量測定參照GB 5009.5—2016，脂肪含量測定參照GB 5009.6—2016，水分含量測定參照GB 5009.3—2016，pH值測定用Testo205 pH計。

1.4.4 活菌數測定

分別在干酪成熟期的第1、30、60、90天取干酪樣品10 g，用90 mL 2%無菌檸檬酸鈉溶液(40 ℃)進行均漿處理(2 min)，經無菌生理鹽水倍比稀釋后，分別涂布于改良MRS和M17固體培養基，37 ℃靜置培養48 h后進行菌落計數。改良MRS固體培養基用于乳桿菌的分離計數，改良M17固體培養基用于乳球菌的分離計數。

1.4.5 質構測定

分別在干酪成熟期的第1、30、60、90天取干酪樣品1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm，室溫放置2 h后，利用物性分析儀對干酪進行全質構分析。選擇P/5探頭，設定測量前探頭下降速度為1.0 mm/s，測試速度為1.0 mm/s，測量后探頭回程速度為5.0 mm/s，下壓變形為10.0 mm，觸發力為0.2 N。

1.4.6 游離氨基酸測定

分別取不同成熟期(1、30、60、90 d)干酪凍干粉樣品30 mg，采用HPLC分析游離氨基酸含量。色譜分析條件：C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：A：0.1 mol/L 97%無水乙酸鈉乙腈溶液(pH=6.5)，B：80%乙腈水溶液；進樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；檢測波長：254 nm。

1.4.7 短鏈脂肪酸測定

分別取不同成熟期(1、30、60、90 d)干酪凍干粉樣品30 mg，采用LC/MS分析短鏈脂肪酸含量。色譜分析條件：HP-INNOWAX色譜柱(25 m×0.20 mm×0.40 μm)；升溫程序：100 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至150 ℃，再以30 ℃/min升至240 ℃，保持30 min；進樣口溫度：240 ℃；載氣流速：1.0 mL/min，不分流；質譜分析條件：離子源溫度：200 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；質譜：EI源轟擊電壓：70 eV，單離子掃描模式：定量離子60、73。

1.4.8 感官評定

在干酪成熟90 d時進行感官評定。選取10名對色、味、質屬性敏感的資深專家組成評定小組(男∶女=1∶1)，對干酪的外型、色澤、紋理圖案、滋味、氣味和組織狀態進行感官評定。評定細則參照RHB 501—2004《切達干酪感官質量評鑒細則》，具體評分標準見表1。

表1 切達干酪感官評定標準Table 1 Sensory evaluation score of Cheddar cheeses

1.5 數據分析

每組實驗重復3次，結果以平均值±標準差(SD)表示。采用SPSS 19.0 統計軟件對數據進行差異顯著性分析，采用GraphPad Prism 6.0軟件作圖，采用CANOCO 4.5軟件對質構、游離氨基酸和短鏈脂肪酸數據進行冗余分析(redundancy analysis，RDA)。

2 結果與分析

2.1 益生菌對干酪成熟期間基本理化指標的影響

由表2可知，在干酪成熟期間，3組干酪中的蛋白質、水分含量及pH值之間存在差異(P<0.05)，脂肪含量無差異(P>0.05)；同一成熟期內各指標無差異，組分變化符合切達干酪成分含量標準(蛋白質20%～30%，脂肪20%～34%，水分<39%，pH<5.3)(質量分數)。這與ONG等[15]和段翠翠等[16]的研究結果一致，即添加附屬發酵劑乳酸菌對干酪的基本理化指標無影響。說明這2株菌可作為附屬發酵劑用于切達干酪的生產。

2.2 益生菌對干酪成熟期間活菌數的影響

益生菌干酪在成熟期內保持較高的活菌數，同時益生菌對干酪的品質無不良影響，是生產益生菌干酪對附屬發酵劑益生菌的基本要求[17]。由圖1可知，益生菌干酪因添加了L.plantarumNA136或P.acidilacticiAS185而使其乳桿菌數(圖1-a)或乳球菌數(圖1-b)明顯高于對照組。各組的活菌數隨干酪成熟逐漸降低；在成熟90 d時，益生菌組活菌數均高于對照組，且益生菌數均在7.5 lgCFU/g以上，符合益生菌食品的活菌數要求(活菌數≥107CFU/g)[17-18]。此外，由圖1-a發現，在第1天時，對照組和AS185組中已檢測到了少量的乳桿菌存在，且隨成熟期延長，乳桿菌含量在增加并于后期趨于穩定。這與GARDE等[19]研究結果一致，即這些乳桿菌可能來源于加工環境。

表2 干酪成熟期間基本理化指標變化Table 2 Changes in physicochemical composition during cheese ripening

a-乳桿菌活菌數；b-乳球菌活菌數圖1 干酪成熟期間活菌數的變化Fig.1 Changes in viable counts during cheese ripening

2.3 益生菌對干酪成熟期間質構的影響

應用物性分析儀對干酪的硬度、咀嚼性、黏聚性、回復性進行分析，可反應干酪的質構特性[20]。由表3可知，隨成熟期延長，各組干酪的硬度和咀嚼度在逐漸增加，黏聚性和回復性在逐漸降低(P<0.05)；在同一成熟期內，益生菌組干酪的硬度均低于對照組，可能是益生菌添加促進了蛋白質水解，使酪蛋白膠束結構變松散，干酪硬度下降、質地變軟[21]。與對照組相比，益生菌對干酪咀嚼度、黏聚性和回復性無顯著影響，這與添加L.plantarum或P.acidilactici菌株為附屬發酵劑的益生菌干酪分析結果一致[5, 16]，益生菌添加對干酪咀嚼度、黏聚性和回復性影響不顯著。

2.4 益生菌對干酪成熟期間游離氨基酸含量的影響

在干酪成熟期間，益生菌附屬發酵劑與主發酵劑菌株共同組成干酪的微生物群落，益生菌產生的多種蛋白酶促進了游離氨基酸的產生和干酪風味的形成[22]。由表4可以知，3組干酪中均檢測出17種游離氨基酸，且隨成熟期延長，游離氨基酸總量逐漸增加。我們的研究結果進一步證實CIOCIA等[23]和STEFANOVIC等[24]的實驗結論，他們的研究發現，添加植物乳桿菌或副干酪乳桿菌，顯著影響干酪中二級蛋白質的水解并促進游離氨基酸的產生。

表3 干酪成熟期間質構指標變化Table 3 Changes in texture characteristics during cheese ripening

表4 干酪成熟期間游離氨基酸含量變化 單位：mg/kg

2.5 益生菌對干酪成熟期間短鏈脂肪酸含量的影響

干酪成熟期間，短鏈脂肪酸因感官閾值較低直接貢獻干酪的芳香味道，同時也是甲基酮、醇、內酯、醛和酯等其他重要風味化合物的前體[25]。由表5可知，3組干酪中，隨成熟期延長，短鏈脂肪酸含量變化存在統計學差異(P<0.05)，總體比較，乳酸片球菌AS185對脂質降解的程度要好于植物乳桿菌NA136。各組乙酸含量顯著高于其他短鏈脂肪酸，且與對照組相比，NA136組和AS185組乙酸含量先增后降，這可能是由于益生菌在干酪成熟前期活性較強，促進乳酸代謝產生乙酸，后期含量降低可能與乙酸作為前體合成其他風味物質有關[26]。在ONG等[15]和EUGSTER等[5]的研究中也證實，益生菌對干酪中乙酸的增加有促進作用。在成熟90 d時，NA136組和AS185組丁酸含量顯著高于對照組(P<0.05)。ATASOY等[27]研究指出，丁酸具有典型的奶酪味，風味較好的切達干酪中丁酸含量在4.5～5.0 mg/kg。本研究中益生菌干酪中的丁酸含量在這一范圍內，說明益生菌對干酪的風味形成有促進作用。另外，其他種類的短鏈脂肪酸含量較低，這也與MOREIRA等[28]的研究結果一致。

表5 干酪成熟期間短鏈脂肪酸含量變化 單位：mg/kg

2.6 益生菌與干酪質構、游離氨基酸和短鏈脂肪酸的關系

采用RDA對成熟90 d干酪中游離氨基酸、短鏈脂肪酸含量與質構的關系進行了分析(圖2)。NA136組干酪的咀嚼度與天冬氨酸、絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、丙酸和丁酸有一定的相關性，說明NA136對上述的生成有促進作用(圖2-a)。NA136也影響了丙酸和丁酸的產生(圖2-b)，并與干酪的咀嚼度有關。另外，AS185更有利于干酪中苯丙氨酸、酪氨酸、賴氨酸、脯氨酸、精氨酸及異丁酸、異戊酸、戊酸等風味物質的形成，但對干酪的質構無影響。

2.7 益生菌干酪感官評定

成熟期為90 d的3組干酪感官評定結果如圖3所示。可以看出，益生菌對干酪的外型、色澤沒有任何影響，但對干酪的紋理圖案、滋味、氣味和組織狀態產生了一些影響。益生菌干酪的紋理圖案和組織狀態得分略低于對照組，而滋味和氣味的得分略高于對照組，綜合得分略低于対照組，但無統計學差異(P>0.05)。這可能是因為益生菌能夠促進蛋白及脂肪的水解，使得干酪的質地變軟，而導致切達干酪中固有的“雞胸紋”圖案紋理不夠清晰，但同時又產生了一些風味物質，促進干酪風味的形成[28]。也有研究指出，添加益生菌可輕微改變干酪的感官特性，但不會對產品的銷售產生不利影響[5, 15]，本研究結果也得到了證實。

1～3-對照組；4～6-NA136組；7～9-AS185組 a-游離氨基酸含量與質構的關系；b-短鏈脂肪酸含量 與質構的關系圖2 干酪中游離氨基酸和短鏈脂肪酸含量與質構的關系Fig.2 Associations of texture and free amino acids and short-chain fatty acids in cheese

圖3 成熟90 d干酪感官評分Fig.3 Sensory score of cheeses ripened after 90 days

3 結論

本研究以自主分離鑒定的植物乳桿菌NA136和乳酸片球菌AS185為附屬發酵劑應用于切達干酪。益生菌對切達干酪的理化指標和質構無不良影響，并促進了干酪中的蛋白質的水解、游離氨基酸和短鏈脂肪酸的生成，對干酪風味的形成和品質的提升起到了促進作用。綜上所述，植物乳桿菌NA136和乳酸片球菌AS185可作為附屬發酵劑用于益生菌干酪的生產。