植物乳桿菌發酵豆乳對多囊卵巢綜合征大鼠腸道菌群紊亂的改善作用

祁亞勁，賀禹豐，楊羽倩，石劉婷，詹語，魯佳欣，郭敏，王慧玲，趙建新，張灝，王剛*，陳衛

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)2(蘇州市立醫院, 南京醫科大學附屬蘇州醫院，南京醫科大學 姑蘇學院，江蘇 蘇州，215002)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡期女性常發的一種異質性內分泌疾病，全球范圍內育齡婦女患病率約8%～13%[1]，主要臨床表現為肥胖、月經失調、雄激素過多、胰島素抵抗、卵巢多囊樣變和代謝性疾病[2-5]。其病因可能與遺傳因素、環境因素、雄激素代謝異常、內分泌異常、腸道菌群等多方面相關[6]。腸道菌群被稱為人體的“第二器官”，達到動態平衡后能夠通過適應腸道環境，使其數量和種類在腸道形成一道屏障，防止脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)進入體循環，從而對機體起到保護作用[7]。而其代謝產物短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAS)可被腸黏膜細胞吸收，確保腸黏膜正常的屏障作用[8]。

已有研究證明，移植健康大鼠腸道菌群的PCOS大鼠血清中雄激素水平下降，發情周期改善，卵巢功能恢復正常[9]，這表明改變腸道菌群可以影響PCOS癥狀，靶向腸道菌群的PCOS療法具有很大應用前景。益生菌是廣為應用的腸道菌群調節劑。目前研究表明，攝入益生菌可以緩解PCOS癥狀：AHMADI等[10]發現，益生菌的攝入可以降低PCOS婦女體重、血糖、甘油三酯、超低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein，VLDL)膽固醇水平；HE等[11]通過對PCOS大鼠進行益生菌干預，發現特定益生菌可以通過調節性激素相關腸道菌群來緩解大鼠PCOS癥狀。石劉婷等[12]研究發現，植物乳桿菌CCFM1019、LP4、LP5發酵豆乳可以改善PCOS大鼠的卵巢病變，降低其血清中睪酮水平，提高其血清中雌二醇水平。為了進一步研究植物乳桿菌發酵豆乳對PCOS的緩解作用是否與腸道菌群調節有關，本研究分析了植物乳桿菌CCFM1019、LP4、LP5發酵豆乳對PCOS大鼠腸道菌群及其代謝物短鏈脂肪酸的影響，以期尋找植物乳桿菌發酵豆乳緩解PCOS的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆，嘉祥永勝食品有限公司；蔗糖，市售；來曲唑片，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose，CMC)，上海麥克林生化科技有限公司；達英-35，拜爾醫藥保健有限公司；Fast DNA Spin Kit for Feces試劑盒，美國MP Biomedicals公司；DNA Gel/PCR Purification Midiprep kit試劑盒，美國BIOMIGA公司；植物乳桿菌CCFM1019、LP4、LP5，江南大學生物技術中心菌種保藏庫。

1.2 儀器與設備

PB300-N電子天平，梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司；GRP-9160型隔水式恒溫培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；5804R Eppendorf高速冷凍離心機，德國艾本德股份公司；超低溫冰箱、氣象色譜質譜聯用儀，美國賽默飛世爾科技公司；高通量組織研磨器，寧波新芝生物科技股份有限公司；PCR儀，美國Bio-Rad公司；Illumina MiSeq高通量測序儀，美國Illumina公司。

1.3 發酵豆乳的制備

不同類型的發酵豆乳制備參照石劉婷等[12]的方法進行。

1.4 動物實驗設計

動物實驗參照石劉婷等[12]設計。詳細處理及分組見表1。

表1 實驗動物分組與處理Table 1 Grouping and treatment of experimental animals

1.5 糞便中短鏈脂肪酸的測定

將50 mg凍干后的糞便樣品置于1.5 mL EP管中，加入500 μL飽和NaCl溶液浸泡糞便，30 min后，采用高通量組織研磨器將糞便破碎至無明顯塊狀物。加入20 μL 10%(體積分數)硫酸溶液進行酸化，加入800 μL乙醚用以萃取短鏈脂肪酸，14 000 r/min離心15 min。離心后取上層乙醚相，將其加入到裝有2 mL 0.25 g無水硫酸鈉的EP管中，14 000 r/min離心15 min。將上清液加入到氣相瓶中，采用GC-MS分析乙酸(acetate)、丙酸(propionate)、異丁酸(isobutyric acid)、丁酸(butyrate)、異戊酸(isovaleric acid)及戊酸(valeric acid)的含量。

1.6 DNA提取和PCR擴增

大鼠麻醉處死前，收集新鮮糞便于無菌塑料管中，-80 ℃快速保存。采用Fast DNA Spin Kit for Feces 試劑盒對糞便的菌群DNA進行提取，并對16S rRNA基因V3～V4可變區進行PCR擴增；采用DNA Gel/PCR Purification Midiprep kit試劑盒純化PCR產物。

1.7 腸道菌群高通量測序

對PCR產物以等摩爾量進行定量和匯總；使用Illumina MiSeq高通量測序儀對樣品進行測序；采用QIIME對16S rRNA序列數據進行處理。對原始reads進行過濾、合并、多路分離以進行質量控制，使用與UCLUST 97%的相似性截止將其聚類為操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)。最后，利用核糖體數據庫項目RDP對每個OTU的分類進行分析。

1.8 數據分析

數據以“均數±標準差”表示，用GraphPad Prism 5進行數據分析并作圖；將實驗數據進行正態分布檢驗，對符合正態分布的數據進行單因素方差分析(Fisher′s LSD檢驗)，對不符合正態分布的數據進行非參數檢驗(Kruskal-Wallis檢驗)；采用IBM SPSS Statistics 20進行顯著性分析采用Spearman進行相關性分析；P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌發酵豆乳對PCOS大鼠糞便中短鏈脂肪酸的影響

如圖1所示，與空白組相比，來曲唑處理的PCOS大鼠糞便中6種短鏈脂肪酸乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸的水平均有所下調；由圖1-c、圖1-e可知，植物乳桿菌CCFM1019、LP5發酵豆乳上調了PCOS大鼠異丁酸、異戊酸水平，但與模型組無統計學差異(P>0.05)。植物乳桿菌LP4發酵豆乳對PCOS大鼠糞便中短鏈脂肪酸水平無明顯影響。

2.2 植物乳桿菌發酵豆乳對PCOS腸道菌群的影響

2.2.1 腸道菌群多樣性分析

通過Observed spieces、Chao 1、Shannon、Simpson指數評估腸道菌群的α多樣性。由圖2可知，空白組與模型組Observed spieces、Chao 1、Shannon、Simpson指數無明顯差異(P>0.05)。與模型組相比，CCFM1019組顯著提高了Observed spieces(P<0.001)、Chao 1(P<0.01)、Shannon(P<0.05)、Simpson(P<0.05)指數，LP4組顯著提高了Observed spieces(P<0.01)、Chao 1(P<0.01)、Shannon指數(P<0.05)，LP5組顯著提高了Observed spieces、Chao 1指數(P<0.05)，說明3種植物乳桿菌發酵豆乳能夠提高PCOS大鼠腸道菌群的物種。

多樣性基于Bray-Curtis距離的主坐標軸分析(principal coordinate analysis，PCoA)(圖3)結果表明，空白組與模型組之間腸道菌群在分布上具有顯著性差異；植物乳桿菌CCFM1019、LP4、LP5發酵豆乳的干預對PCOS大鼠腸道菌群結構的調節具有一定相似性，但與模型組相比，組成上具有顯著性差異。進一步非參數多元方差分析(Adonis)分析顯示，3株植物乳桿菌發酵豆乳干預后的PCOS大鼠腸道菌群結構上無顯著性差異且明顯區別于空白組與模型組的腸道菌群(表2)。這提示，3株植物乳桿菌發酵豆乳的干預對PCOS大鼠腸道菌群造成影響，雖然未能使PCOS大鼠腸道菌群恢復至正常，但是結合3株植物乳桿菌發酵豆乳對PCOS大鼠癥狀的緩解作用，我們認為，植物乳桿菌CCFM1019、LP4、LP5發酵豆乳能夠將PCOS大鼠腸道菌群調節到一種新的穩態，而這種穩態有利于PCOS大鼠病理表型的恢復。

表2 Adonis分析數據Table 2 Data analysis of Adonis

2.2.2 腸道菌群組成分析

研究考察了門水平的菌群變化，各實驗組大鼠的腸道菌群主要由Firmicutes、Bacteroidetes構成(圖4)。與空白組相比，來曲唑誘導的PCOS大鼠Firmicutes、Bacteroidetes水平未發生明顯改變。與模型組相比，植物乳桿菌CCFM1019發酵豆乳降低了Firmicutes相對豐度并提高了Bacteroidetes相對豐度，從而降低了Firmicutes/Bacteroidetes值但差異無統計學意義(P>0.05)；植物乳桿菌LP4、LP5發酵豆乳的干預效果與CCFM1019組相反，且差異無統計學意義(P>0.05)(圖5)。

各實驗組大鼠腸道菌群屬水平組成如圖6所示。與模型組相比，植物乳桿菌CCFM1019發酵豆乳顯著降低了Lactobacillus(P<0.001)、PrevotellaceaeUCG-001(P<0.01)相對豐度，同時降低了RuminococcaceaeUCG-014相對豐度，但差異無統計學意義(P>0.05)；植物乳桿菌LP4發酵豆乳顯著降低了Lactobacillus(P<0.01)、PrevotellaceaeUCG-001(P<0.01)相對豐度，同時降低了RuminococcaceaeUCG-014、Parabacteroides相對豐度，提高了Lachnospira、Anaerostipes相對豐度，差異無統計學意義(P>0.05)；植物乳桿菌LP5發酵豆乳顯著降低了Lactobacillus(P<0.05)、PrevotellaceaeUCG-001(P<0.001)相對豐度，同時降低了RuminococcaceaeUCG-014、Parabacteroides相對豐度，提高了Anaerostipes相對豐度，但差異無統計學意義(P>0.05)(圖7)。

2.3 腸道菌群與短鏈脂肪酸、性激素水平的相關性分析

前期研究了植物乳桿菌發酵豆乳的干預對性激素水平的影響[12]。本研究進一步對腸道菌群和短鏈脂肪酸、性激素水平相關性進行了Spearman分析。由圖8可知，Lactobacillus的相對豐度與睪酮呈正相關，并且相關性有統計學意義(P<0.05)；PrevotellaceaeUCG-001的相對豐度與促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)呈正相關，并且相關性有統計學意義(P<0.05)；RuminococcaceaeUCG-014的相對豐度與GnRH呈正相關，與異戊酸水平呈負相關，且2種相關性均具有統計學意義(P<0.05)；Lachnospira的相對豐度與雌二醇呈正相關(P<0.05)。各實驗組大鼠性激素水平見石劉婷等[12]的研究。

a-乙酸水平；b-丙酸水平；c-異丁酸水平；d-丁酸水平；e-異戊酸水平；f-戊酸水平圖1 植物乳桿菌發酵豆乳對PCOS大鼠糞便中短鏈脂肪酸水平的影響Fig.1 Effect of L.plantarum fermented soymilk on fecal SCFAs of PCOS rats

a-Observed spieces指數；b-Chao 1指數；c-Shannon指數；d-Simpson指數圖2 植物乳桿菌發酵豆乳對PCOS大鼠腸道菌群α多樣性的影響Fig.2 Effect of L.plantarum fermented soymilk on α diversity of gut microbiota in PCOS rats 注：*與模型組比較，P<0.05；**與模型組比較，P<0.01；***與模型組比較，P<0.001；#與空白組相比，P<0.05；##與空白組比較，P<0.01； ###與空白組比較，P<0.001(下同)

圖3 基于Bray-Curtis距離的PCoAFig.3 PCoA analysis by the Bray-Curtis

圖4 各門水平所占比例Fig.4 The proportion of each phylum level

a-Firmicutes相對豐度；b-Bacteroidetes相對豐度； c-Firmicutes/Bacteroidetes比值圖5 植物乳桿菌發酵豆乳對PCOS大鼠腸道菌群門 水平的影響Fig.5 Effect of L. plantarum fermented soymilk on the phylum level of gut microbiota in PCOS rats

圖6 各屬水平所占比例Fig.6 The proportion of each genus level

3 結論

近年來的研究表明，PCOS患者與健康人體之間腸道菌群存在顯著差異[13-14]，腸道菌群失調可能通過影響微生物相關物質及代謝物，包括膽汁酸[15]、短鏈脂肪酸[16]和LPS[17]等觸發PCOS癥狀。通過腸道微生物調節劑(如益生菌)的干預可以改善腸道菌群失調以緩解POCS癥狀[16,18]。本研究通過對PCOS大鼠灌胃植物乳桿菌CCFM1019、LP4、LP5發酵豆乳發現：3種植物乳桿菌發酵豆乳顯著提高了PCOS大鼠腸道菌群的α-多樣性，且干預后大鼠的腸道菌群與模型組相比具有顯著差異。植物乳桿菌CCFM1019

a-Lactobacillus相對豐度；b-Prevotellaceae UCG-001相對豐度；c-Ruminococcaceae UCG-014相對豐度；d-Anaerostipes相對豐度； e-Parabacteroides相對豐度；f-Lachnospira相對豐度圖7 植物乳桿菌發酵豆乳對PCOS大鼠腸道菌群屬水平的影響Fig.7 Effect of L. plantarum fermented soymilk on the genus level of gut microbiota in PCOS rats

圖8 短鏈脂肪酸、性激素與不同屬的相關性Fig.8 Correlation between sex hormones, SCFAs and differential genera 注：*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001

發酵豆乳表現出了降低Firmicutes/Bacteroidetes的趨勢。Firmicutes與Bacteroidetes的比值與肥胖密切相關[19]，因此CCFM1019發酵豆乳的干預可能有利于肥胖PCOS患者體重的下降。此外與模型組相比，3種植物乳桿菌發酵豆乳均能顯著降低Lactobacillus、PrevotellaceaeUCG-001相對豐度，同時有降低Ruminococcaceae UCG-014相對豐度的趨勢。SHERMAN等[20]發現Lactobacillus的減少可以改善腸道屏障功能；ZHANG等[21]發現，與正常人群相比，Prevotellaceae在肥胖人群腸道中含量豐富，這可能與其能夠發酵膳食纖維，促進機體吸收營養成分有關。王萍等[22]發現，瘤胃球菌屬與身體代謝機制有關，HALL等[23]研究發現，Ruminococcusgnavus與腸道慢性炎癥顯著相關。相關性分析結果表明，Lactobacillus的豐度與睪酮呈正相關；PrevotellaceaeUCG-001、RuminococcaceaeUCG-014的豐度與GnRH呈正相關。3種植物乳桿菌發酵豆乳可能是通過下調Lactobacillus、PrevotellaceaeUCG-001、RuminococcaceaeUCG-014相對豐度來調節睪酮、GnRH水平以緩解PCOS癥狀。

綜上所述，植物乳桿菌CCFM1019、LP4、LP5發酵豆乳能夠調節PCOS大鼠的腸道菌群多樣性以及特定菌群的組成，這些菌群的相對豐度與大鼠的性激素水平具有一定相關性。說明植物乳桿菌CCFM1019、LP4、LP5發酵豆乳可能通過調節腸道菌群來影響PCOS大鼠的性激素水平。進一步研究3種發酵豆乳及豆乳中差異性物質、以及這些差異物質對腸道內環境的影響，將有助于進一步解析植物乳桿菌發酵豆乳緩解PCOS癥狀的機制。