扶正化瘀方制劑抗肝纖維化的國際化與現代化研究進展

文 劉成海 孫鑫 趙志敏（上海中醫藥大學肝病研究所，上海市中醫臨床重點實驗室）

由中藥復方形成的中成藥制劑，雖然其組方與應用受到中醫理論指導，但做為一種天然藥物，有著化學藥物相似的要求：產品制劑的穩定可靠性、臨床療效的可重復性、臨床使用的安全性、以及作用原理的可明性。這些國際上的通行認識與要求，也是中藥現代化發展的重要目標與內容，因此中醫藥的國際化與現代化常常互為一體，相互促進。近10余年來，圍繞扶正化瘀方制劑（片劑或膠囊）的美國注冊臨床試驗，我們與國內外同行進行了相關臨床與基礎工作，部分進展如下。

一、美國多中心臨床試驗提示扶正化瘀片對慢性丙肝顯著肝纖維化患者有良好作用

肝纖維化是肝臟對慢性損傷的一種修復反應，以肝組織內細胞外基質(ECM) 成分的過度增生與異常沉積為特征，可導致肝硬化及其門脈高壓，逆轉或減輕肝纖維化是慢性肝病的重要治療措施。肝纖維化病理機制復雜，涉及肝實質細胞損傷、肝星狀細胞(HSC)增殖活化、肝竇內皮細胞去分化、肝巨噬細胞表型變化等多個環節多個途徑病理變化，因而基于單一靶點的生物或化學藥物目前尚未取得明顯進展，現代醫學的抗肝纖維化進展主要在于抗病毒等病因治療，因此國內外對抗肝纖維化一直有重大需求。2002年扶正化瘀方制劑（片劑或膠囊）國內上市后，在乙肝相關肝纖維化患者廣泛應用，促進了患者的康復。對于其他病因的肝纖維化有無作用？基于這個問題，我們與美國肝病專家聯合開展了相關臨床研究。

2013年，扶正化瘀片完成抗慢性丙型肝炎肝纖維化美國FDA注冊II期臨床試驗，同年11月在美國肝病年會衛星會上報告研究結果（圖1）。該研究是在貝勒醫學院、斯坦福大學、加州大學戴維斯分校等多中心開展的隨機雙盲安慰劑對照觀察，主要以治療前后肝組織活檢的纖維化程度改變為療效評價指標，該研究主要負責人、加利福尼亞大學圣地亞哥分校Hassanein教授表示，研究驗證了扶正化瘀片治療慢性丙型肝炎肝纖維化的安全性、耐受性及有效性，扶正化瘀片顯示出具有阻止肝纖維化的良好趨勢，并構建了中西醫肝病交流的橋梁。

圖1.2013年11月扶正化瘀片在美國肝病年會期間召開衛星會

其后，研究者又對治療前后兩次肝活檢樣本做了二次諧波震蕩/ 雙光子激發熒光（SHG/TPEF）顯微鏡成像分析，通過定量肝纖維化（qFibrosis）的方法計算評估肝纖維化程度。整個過程操作者采用盲法評判，并分別將匯管區（Zone1,1區）、中央靜脈區（Zone3,3區）和中間區（Zone2,2區）等3個不同分區的纖維化進行分析，結果顯示：與安慰劑組相比，扶正化瘀片對基線時Ishak纖維化分期為F3和F4的丙肝肝纖維化患者有良好的消退效果，并且qFibrosis分析證實：與安慰劑組相比，扶正化瘀片組患者肝組織病理3個區域的纖維化程度均顯著改善。

二、扶正化瘀方的多途徑作用機制與活性成分被不斷揭示，促進對中藥復雜綜合作用機制的認識與中藥成分新復方的發展

扶正化瘀方抗肝纖維化藥理復雜，包括：1.通過調節死亡受體介質和線粒體通路抑制肝細胞凋亡，抗氧化應減輕肝細胞炎性壞死等。（2）通過調節轉化生長因子β1（TGF-β1）/Smads、PDGFBB/MAPK、及FN/整合素等信號通路，扶正化瘀方抑制肝星狀細胞活化。HSC是肝纖維化的細胞學基礎，受到肝細胞損傷與巨噬細胞等分泌的促炎性與促纖維化因子如氧化自由基、TGF-β1等的刺激，而發生活化，生成細胞外基質。我們實驗室、香港大學、美國加州大學圣迭戈分校[6-8]等均發現相似結果：扶正化瘀方可抑制體內模型大鼠肝組織與體外TGF-β1誘導的HSC活化，其作用機制與調控TGFβ/Smad、PDGF-BB/MAPK、及FN/整合素等信號轉導有關。

新近我們與美國斯坦福大學合作研究發現：扶正化瘀方通過調節HIF-1α/VEGF/ERK通路改善肝竇內皮細胞損傷和抑制肝血管新生。肝竇內皮損傷后，促血管新生信號分子（如VEGF/PDGF等）表達增加，不僅促進HSC活化，也促進肝臟血管新生，導致肝竇毛細血管化，構成肝纖維化與門脈高壓的重要病理基礎。扶正化瘀方改善肝竇毛細血管化，減輕門脈壓力，其機制除了抑制HSC活化、減少TIMP1表達與促進間質性膠原酶活性外，與下調HIF-1α、VEGF/MAPK信號通路，抑制肝竇內皮細胞去分化及其肝血管新生密切有關。

我們近年提出“肝纖維化免疫微環境”概念[10]，其有肝內NK細胞、巨噬細胞、肝星狀細胞、肝竇內皮細胞等構成，其中免疫細胞對于啟動與維持肝纖維化有重要作用。而扶正化瘀方調節肝臟巨噬細胞CCL2/CX3CL1軸、促進其從M1向M2型極化，并影響肝臟巨噬細胞的募集而抗肝纖維化。

既往我們在肝纖維化患者與實驗動物中，發現扶正化瘀方有32種明顯入血成分，包括丹參酮IIA、丹酚酸B、五味子醇甲、苦杏仁苷、商陸素、松花粉、大豆苷元等。隨后采用細胞高內涵篩選評價等技術，以肝星狀細胞、肝細胞、內皮細胞等細胞模型，HL-7702，發現9種成分具有較強的抗纖維化活性：丹酚酸B、迷迭香酸、咖啡酸、原兒茶醛、丹參素鈉，蟲草腺苷、五味子丙素等，以3種成分作用最為顯著。而后根據這些成分的活性作用與體內過程等特點，經過多次實驗，形成以7種成分組成扶正化瘀成分新復方，動物實驗證實對肝纖維化有良好作用。這不僅說明扶正化瘀方確實存在活性成分，且也證實了我們此前基于肝細胞、肝星狀細胞與內皮細胞等對扶正化瘀方的機制認識是正確的，并為新一代的抗肝纖維化中藥研發提供了參考。

三、中藥化學成分測定與全方生物活性測定相結合，促進扶正化瘀方制劑產品的質量可控性

經過多年努力，扶正化瘀方制劑（膠囊/片劑）已經建立從源頭（栽培種植、形狀鑒別等）、過程（生產工藝等）、到指標控制（成分檢測等）的較為完備的質量控制體系，在這三大質控環節中，分別形成GAP藥材栽培種植、藥材外觀形狀鑒別、化學定性鑒別、指標成分檢測、化學指紋圖譜等方法，來保證不同批次中藥的一致性。這些質控方法與標準完全滿足國家藥品管理相關要求，基本保證了產品質量。尤其是指紋圖譜分析，克服了單一成分檢測缺點，可整體性反映物質群，符合中藥多組分與多靶點特點，是目前中藥質量評價的重要方法。

但是，在我們完成扶正化瘀片抗肝纖維化的II期臨床試驗，準備開展III期臨床試驗時遇到新挑戰：美國FDA明確要求扶正化瘀片需建立生物活性的質量控制標準，以保證不同批次間產品的穩定性。基于化學基準的質量控制常用于化學藥物等，但對于中藥存在一定局限性，會出現中藥復方檢出成分與功效之間關聯性差的情況，究其主要原因在于：（1）中藥成分組成復雜，種類繁多，中藥復方更是加重了這種復雜性，目前無法檢測到中藥全部成分并進行質量控制。（2）中藥成分并非一成不變。受植物產地、生長時間、季節、加工、炮制等多種因素，可導致中藥成分組成變化。（3）所測成分并非有效成分，缺乏專屬性與代表性。選擇含量高、反應快、容易檢出的成分進行檢測，雖然這些成分是中藥的固有物質，但不一定是復方所針對適應癥的活性成分。臨床療效是中藥物質成分群的最終反映與價值所在，而生物活性則是療效實現的前提與基礎。因此中藥的質量控制，除了化學成分檢測，尚需要結合生物活性評價。

關鍵靶標分子控制細胞信號轉導，影響或決定藥物療效，中藥具有調節細胞信號轉導的多途徑作用機制，一定的藥物靶標群活性可反映中藥復方的特定療效，作為其生物活性質量評價的新方法。因此，我們通過網絡藥理學并結合細胞分子藥理等方法，首先明確扶正化瘀方抗肝纖維化的關鍵作用靶標，針對該靶標群，構建熒光素酶報道基因與融合蛋白的穩轉細胞株，建立藥物靶標群的基因轉錄與蛋白活性測定平臺。通過檢測扶正化瘀方抗肝纖維化的主要藥物靶標的生物活性，以評價中藥復方的藥效作用與產品質量。將該中藥復方指標質控方法從既往以植物成分為主，改變為復方生物活性+中藥活性成分相結合，從“就藥論藥”到“醫藥結合”，既可滿足FDA的III期臨床試驗要求，也可促進中藥復方關鍵作用制劑的進一步明確。目前，我們以建立扶正化瘀浸膏粉的標準體外給藥方法，確定NF-κB與Smad3等扶正化瘀方抗肝纖維化主要靶標，進行慢病毒包裝并感染293T細胞，抗性篩選后獲得穩定表達NF-κB-luc2和Smad3-luc2等的細胞株，建立了相關熒光素酶報告基因穩轉細胞株，以評價復方的抗肝纖維化活性作用。