老年心力衰竭患者血漿中環狀RNA的差異性表達

張悅，嚴光,顧辨辨，孫夢雯，張薇薇，張婉秋

安徽醫科大學附屬省立醫院老年醫學科，合肥 230001

心力衰竭是指由多種原因導致的心臟結構或功能異常改變，使心室收縮或舒張功能發生障礙，從而引起的一組復雜的臨床綜合征，是許多心臟疾病的共同的終末階段[1-2]。隨著人口老年化的推進，心力衰竭的發病率不斷上升，已成為老年人住院和病死的主要原因之一[3-4]。早期篩查、診斷和治療是心力衰竭老年患者預后的重要措施。目前臨床上廣泛應用的心力衰竭生物標志物如N末端B型利鈉肽原存在一定的局限性[5]，新的理想心力衰竭生物標志物有待發掘。環狀RNA是一類內源性非編碼RNA，具有高度保守、結構穩定、高表達量、組織特異性和發育階段特異性等優點，有成為生物標志物的潛質[6-9]。多項研究顯示環狀RNA參與多種心血管疾病過程，且在心力衰竭心肌重構病理變化中具有重要的作用[8,10]。本研究通過檢測環狀RNA在老年心力衰竭患者血漿中的表達情況，研究其表達譜特征，為進一步研究環狀RNA在老年心力衰竭中的作用提供方向。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2020年8月至2021年8月安徽省立醫院住院確診為心力衰竭的老年(大于60歲)患者4例為研究組，患者均符合《中國心力衰竭診斷和治療指南2018》[11]的診斷標準；選取同期無任何心血管疾病的健康老年人4例為對照組。所有研究對象均無其他重要器官系統疾病，如糖尿病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤、肝腎功能障礙、全身性急慢性炎癥等。2組對象基本資料進行比較，差異均無統計學意義(P值均>0.05)，見表1。

表1 2組患者的基本資料比較

1.2 研究方法

1.2.1 提取血漿總RNA 所有研究對象均采集外周血5 mL，1 000 r/min離心10 min后分離出血漿，在-70 ℃環境下保存。根據試劑說明書使用TRIZOL試劑盒(Epicentre公司)分別提取研究組和對照組血漿的總RNA，通過檢測所提取RNA在230、260和280 nm處的吸光度值來評價總RNA的純度及濃度。

1.2.2 環狀RNA芯片檢測 采用Rnase R(Epicentre公司)去除質檢合格的樣本中的線性RNA，并富集環狀RNA，將富集的環狀RNA擴增和轉錄成熒光標記的cRNA(Arraystar公司)，后將標記熒光的cRNA與Arraystar Human circRNA Array V2(Arraystar公司)雜交，Agilent清洗液試劑盒清洗芯片后用Agilent G2505C固定和掃描。

1.3 統計學方法 采用SPSS 26.0和R軟件進行整理分析。以變化倍數>1.5倍、獨立樣本t檢驗的P<0.05為截斷點對2組患者之間的環狀RNA進行篩選，篩選出差異表達的環狀RNA。通過TargetScan和miRanda數據庫預測最可能與這些差異表達的環狀RNA結合的微小RNA。

2 結果

2.1 原始樣本環狀RNA表達情況 通過數據的歸一化處理后，原始樣本中環狀RNA表達分布結果顯示8份樣本中環狀RNA表達分布幾乎是相同的，可以進行下一步的分析。

2.2 層次聚類分析 根據各組標本中環狀RNA的表達譜差異進行監督性層次聚類分析，結果表明2組間環狀RNA的表達譜具有明顯差異。

2.3 老年心力衰竭患者環狀RNA表達譜的差異 將研究組和對照組分析獲得的差異性環狀RNA繪制成火山圖(圖1)。比較2組血漿中環狀RNA，篩選出差異表達的環狀RNA共190種(變化倍數>1.5，P<0.05)，其中表達上調的有116種，下調的有74種。根據變化倍數和P值進行排序的高表達和低表達的前10名環狀RNA。

2.4 生物信息學分析 通過TargetScan和miRanda數據庫對表達上調和下調的前10名的環狀RNA的微小RNA結合位點進行預測，匹配值較高的5個微小RNA見表2、表3。查閱相關文獻發現，miR-764、miR-410-3p、miR-483-3p、miR-148b-3p可能與心肌損傷有關，miR-204-5p可能與心肌肥大相關，miR-17-3p、miR-134-5p可能與心肌衰老和凋亡有關，而hsa_circRNA_102228、hsa_circRNA_102227、hsa_circRNA_102225、hsa_circRNA_027610、hsa_circRNA_006240、hsa_circRNA_103327與上述微小RNA存在結合位點，這些環狀RNA可能通過靶向吸附上述微小RNA調控老年心力衰竭的發生和發展。

表2 與明顯上調的環狀RNA匹配值較高的5個微小RNA

表3 與明顯下調的環狀RNA匹配值較高的5個微小RNA

3 討論

心力衰竭作為多種心臟疾病的共同的終末階段，嚴重威脅著老年人的生命安全[1-4]。而現階段心力衰竭的早期篩查和診斷仍有許多不足，尋找新的理想心力衰竭生物標志物至關重要。環狀RNA是一類不具有5’末端帽結構和3’末端多聚腺苷酸尾結構，由共價鍵形成閉環結構的RNA分子[12]。環狀RNA的高度保守、結構穩定、高表達量、組織特異性和發育階段特異性等特點，使其具有成為新的生物標志物的可能[6-9]。環狀RNA能夠作為微小RNA海綿，通過與微小RNA結合降低其活性，阻礙微小RNA對靶基因的抑制作用，從而在疾病的發生發展中發揮作用[13-14]。目前已有多項研究表明環狀RNA參與多種心血管疾病發生發展過程，包括在心力衰竭心肌重構病理變化中具有重要的作用[8,10]。環狀RNA在老年心力衰竭患者中的臨床價值仍需進一步的探索。

本研究通過高通量環狀RNA芯片技術檢測了老年心力衰竭患者與無任何心血管系統疾病的老年人血漿中環狀RNA表達譜。研究結果顯示環狀RNA在老年心力衰竭患者血漿中的表達與健康對照組差異有統計學意義，差異表達的環狀RNA共190種(變化倍數>1.5，P<0.05)，其中在老年心力衰竭患者血漿中表達上調的有116種，下調的有74種，這提示環狀RNA可能與老年心力衰竭的發生發展具有一定的相關性。查閱相關文獻后發現，miR-764、miR-410-3p、miR-483-3p、miR-148b-3p可能與心肌損傷有關[15-18]，miR-204-5p可能與心肌肥大相關[19]，miR-17-3p、miR-134-5p可能與心肌衰老和凋亡有關[20-21]，而本研究篩選出的差異性表達的hsa_circRNA_102228、hsa_circRNA_102227、hsa_circRNA_102225、hsa_circRNA_027610、hsa_circRNA_006240、hsa_circRNA_103327與上述微小RNA存在結合位點，這些環狀RNA可能通過靶向吸附上述微小RNA參與調控老年心力衰竭的發生和發展。

綜上所述，環狀RNA在老年心力衰竭患者血漿中的差異性表達揭示了環狀RNA可能與老年心力衰竭的發生發展具有一定的相關性。環狀RNA可能通過作用于微小RNA參與了心力衰竭病理過程的發生發展。另外，本文研究中納入的樣本量較小，對于這些差異性環狀RNA在老年心力衰竭患者中的具體表達水平還需要在大樣本量的病例及分子機制研究中進行確認。