樺樹皮中樺木醇重結晶純化工藝優化

李镕基 鄭克煒 陳海燕

(1. 吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130000；2. 浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江 舟山 316000；3. 長春科技學院生命科學學院，吉林 長春 130000)

白樺(Betulapubescens.)為耐寒落葉喬木，分布于北亞、北美、北歐的寒帶、寒溫帶地區，在中國東北、華北、西北、西南等地均有生長[1-2]。樺樹皮中含有三萜類、揮發油類、鞣質類、甾體類化合物等多種化學成分[3-4]，具有清熱利濕、鎮咳祛痰等功效[5-7]，可用于治療燒燙傷、炎癥、疥瘡、黃疸、乳癰等疾病，且在降血脂、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等方面表現出了較強的生理活性[8-9]。樺木醇(Betulin)屬于羽扇豆烷型的五環烯類化合物，又名白樺脂醇，是一種生物活性因子，在白樺樹皮中含量尤為豐富，為白色晶體粉末，熔點256 ℃，難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯和氯仿等有機溶劑。

李志興等[10]研究表明，樺木醇對機體體力疲勞具有緩解作用。Chen等[11]研究發現，樺木醇具有較高的抗氧化效果，針對FRAP、DPPH、ABTS等自由基均表現出清除能力。剛小青等[12]通過皮下注射宮頸癌細胞系c4-1建立異種移植瘤模型，經白樺脂醇治療后發現，樺木醇可提高存活率是因為抑制了裸鼠體內c4-1移植瘤體積的增長。Rzeski等[13]利用體外培養評價樺木醇在人類腫瘤細胞系和原代培養的腫瘤細胞中的抗癌活性，證明了樺木醇在腫瘤細胞培養中具有顯著的抗增殖作用。

目前樺木醇的提取方法主要有超臨界萃取法、溶劑回流提取法、超聲提取法、連續提取法等。丁為民等[14]采用超臨界CO2法萃取樺樹皮中的樺木醇，當萃取溫度為32 ℃、萃取壓力為8 MPa、萃取時間為1 h、CO2流量為20 kg/h時，樺木醇得率為16.96%，含量可達74.88%。易金娥等[15]采用甲醇作為溶劑，通過加熱回流法，并用堿溶液處理提取物體系，再經減壓蒸干，乙醇溶解，過濾后留上層液體，最后經減壓濃縮制取樣品。殷涌光等[16]采用超聲波技術對樺褐孔菌中的樺木醇進行優化提取，當采用丙酮作溶劑時，樺木醇的提取質量比最高為9.868 g/kg。馬博玉等[17]采用液泛提取設備對白樺樹皮中的樺木醇進行連續提取，從而優化了液泛連續提取樺木醇的工藝條件。肖涵[18]曾采用超聲提取法提取樺木醇，提取率為92.6%，而采用索氏提取法可以顯著提高樺木醇提取率。

研究擬以長白山地區的白樺樹皮為原料，經不同體積分數的乙醇浸提后采用索式提取及無水乙醇重結晶法聯合純化樺木醇，并分析其體外抗氧化活性，旨在為后期樺木醇的研究及相關產品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

白樺樹皮：經長春科技學院生藥教研室鑒定為樺木科樺木屬白樺種落葉喬木(Betulapubescens.)的干燥樹皮，市售；

大孔吸附樹脂：AB-8型，山東東鴻化工有限公司；

甲醇、乙腈：色譜純，天津市富宇精細化工有限公司；

樺木醇標準品、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、乙醇、香草醛、冰乙酸、抗壞血酸、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀：分析純，上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

電子天平：JJ50型，常熟市雙杰測試儀器廠；

循環水真空泵：SHZ-D(III)型，邦西儀器科技(上海)有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：GZX-9140MBE型，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；

數顯恒溫水浴鍋：HHS-21-6型，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；

紫外可見分光光度計：UVmini-1280型，島津儀器(蘇州)有限公司；

超高效液相色譜—電噴霧四級桿串聯質譜連用儀：Waters UPLC-Quattro Premier XE型，美國 AquityTM Waters 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樺木醇粗品得率、純度及綜合收率計算 分別按式(1)～式(3)進行計算。

(1)

式中：

P——樺木醇得率，%；

m0——樺樹皮粉末重量，g；

m1——容器重量，g；

m2——干燥后樺木醇和容器的重量，g。

(2)

式中：

S——樺木醇純度；

Sq——樺木醇峰面積；

b——標準曲線截距；

K——標準曲線斜率；

C——配液濃度。

Y=P×50%+S×50%，

(3)

式中：

Y——綜合收率，%。

1.2.2 樺木醇提取單因素試驗

(1) 乙醇體積分數：固定料液比(m白樺樹皮∶V乙醇)1∶30 (g/mL)、提取時間1.5 h、提取溫度95 ℃，考察乙醇體積分數(70%，75%，80%，85%)對樺木醇提取率的影響。

(2) 料液比：固定提取時間1.5 h、乙醇體積分數80%、提取溫度95 ℃，考察料液比[m白樺樹皮∶V乙醇分別為1∶25，1∶30，1∶35，1∶40 (g/mL)]對樺木醇提取率的影響。

(3) 提取溫度：固定料液比(m白樺樹皮∶V乙醇)1∶30 (g/mL)、乙醇體積分數80%、提取時間1.5 h、考察提取溫度(90，95，100 ℃)對樺木醇提取率的影響。

(4) 提取時間：固定料液比(m白樺樹皮∶V乙醇)1∶30 (g/mL)、乙醇體積分數80%、提取溫度95 ℃，考察提取時間(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h)對樺木醇提取率的影響。

1.2.3 樺木醇提取工藝響應面法優化試驗設計 在單因素試驗基礎上，根據 Box-Behnken中心組合設計原理[19-21]，以樺木醇提取率為響應值，以乙醇體積分數、料液比、提取溫度和提取時間為響應因素，進行四因素三水平響應面分析試驗。

1.2.4 樺木醇結晶得率計算 將抽濾所得樺木醇結晶于50 ℃干燥5 h，按式(4)計算樺木醇結晶得率。

(4)

式中：

P——樺木醇結晶得率，%；

m0——結晶前樺木醇質量，g；

m1——結晶出的樺木醇質量，g。

1.2.5 樺木醇純化試驗方案 根據1.2.3所得優化提取方案，選擇將 15 g干燥的白樺樹皮剪成近似1 cm2的方形碎片，用95%乙醇溶液，液固比為50∶1 (mL/g)浸泡120 h，過濾，50 ℃加熱回流5 h，減壓蒸餾，將液體轉移到坩堝中繼續蒸干，得初提物，待重結晶備用。

(1) 甲醇—氯仿重結晶法：參照文獻[22]的方法并修改。取0.50 g初提物，將提取液減壓蒸餾后用乙醇重結晶3次，再用甲醇/氯仿(V甲醇∶V氯仿為1∶1)，按V甲醇—氯仿溶液∶m固體=40∶1 (mL/g)進行重結晶，靜置過夜，抽濾，得白色針狀的樺木醇固體。

(2) 無水乙醇重結晶法：參照文獻[23]的方法并修改。取0.50 g初提物，以70 mL乙酸乙酯為溶劑，加熱回流90 min，趁熱過濾。于坩堝中50 ℃濃縮至干。以無水乙醇為溶劑進行重結晶，V無水乙醇∶m固體=30∶1 (mL/g)，-20 ℃重結晶，室溫過濾，50 ℃烘干。

(3) 吸附層析法：參照文獻[23]的方法并修改。取0.50 g 初提物，用AB-8型大孔吸附樹脂吸附層析，使用乙酸乙酯洗脫，洗脫液回收乙酸乙酯至干，加入15倍無水乙醇加熱溶解，0 ℃以下冷沉，過濾，干燥。

1.2.6 樺木醇含量測定 采用香草醛—冰乙酸顯色法[18]。

1.2.7 樺木醇LC-MS檢測

(1) 液相條件：色譜柱為Acquity BEH C18，1.7 μm，2.1 mm×50 mm；流動相A為0.01%甲酸溶液，流動相B為甲醇；柱溫45 ℃；流速0.25 mL/min。

(2) 質譜條件：Quattro Premier XE；ESI正離子檢測方式；離子對443.7/191.1；脫溶劑溫度380 ℃、源溫110 ℃、毛細管電壓3.00 kV、錐氣孔大小80 L/Hr、脫溶劑氣大小600 L/Hr。

1.2.8 樺木醇的抗氧化試驗

(1) DPPH自由基清除能力：參照金建等[24]的方法。

(2) 羥基自由基清除能力：參照楊艷等[25]的方法。

(3) 總還原力：參照毛跟年等[26]的方法。

1.2.9 數據處理 采用SPSS 17.0軟件對試驗數據進行分析,采用Origin 8.0 軟件對分析后的試驗數據進行作圖。

2 結果與分析

2.1 樺木醇提取單因素試驗

由圖1(a)可知，當乙醇體積分數為80%時，樺木醇提取率最高，繼續增大乙醇體積分數，樺木醇提取率降低，故選擇80%為乙醇最佳體積分數。由圖1(b)可知，當料液比為1∶30 (g/mL)時，樺木醇提取率最高，繼續增大料液比，樺木醇提取率降低，故選擇1∶30 (g/mL)為最佳提取料液比。由圖1(c)可知，在試驗范圍內提取溫度對提取率的影響不明顯，可能是由于90～100 ℃皆高于乙醇的沸點，乙醇溶液的蒸發速率相差不大，考慮節約能源成本和提取效果，選擇95 ℃為最佳提取溫度。由圖1(d)可知，當索氏提取時間為1.5 h時，樺木醇的提取率最高，時間過長可能會導致除目標物以外的其他成分也會被提取出來，因此最佳提取時間設定為1.5 h。

圖1 各因素對樺木醇提取率的影響Figure 1 The influence of various factors on the extraction rate of betulin

2.2 響應面法優化樺木醇提取工藝

2.2.1 試驗設計與結果 在單因素試驗基礎上，以乙醇體積分數、料液比、提取溫度和提取時間為影響因素，以樺木醇提取率為響應值，利用Design-Expert 10軟件進行響應面回歸分析，優化樺木醇提取工藝。試驗因素水平設計見表1，試驗設計與結果見表2，方差分析見表3。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Response surface test factor level table

表2 樺木醇提取響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface test design and results of betulin extraction scheme

表3 回歸模型方差分析?Table 3 Analysis of variance of regression model

應用Box-Behnken試驗設計原理對表2數據進行處理，得二次多元回歸方程：

Y=66.02+1.38A-0.061B+2.14C+1.04D+2.50E-0.03AB-0.90AC+0.83AD-1.53BC+0.024BD-0.40CD-3.37A2-2.81B2-4.27C2-5.40D2。

(5)

2.2.2 響應曲面分析 由圖2可知，各因素交互作用對樺木醇提取率均有一定影響，其中以提取溫度和料液比的交互作用所形成的曲面相對陡峭，表明其對試驗結果的影響最為顯著，與方差分析結果一致。

圖2 各因素相互作用對樺木醇提取率的影響Figure 2 The influence of various factors on the extraction rate of betulin

2.2.3 驗證實驗 經響應面分析優化的最佳工藝參數為乙醇體積分數80.928%、料液比1∶29.621 (g/mL)、提取溫度96.199 ℃、提取時間1.551 h，此時樺木醇提取率為66.455%。考慮實際操作的可行性，將工藝參數修正為乙醇體積分數80%、料液比1∶30 (g/mL)、提取溫度95 ℃、提取時間1.5 h，實測樺木醇提取率為66.21%，與預測值較接近，證明此優化方案可行，在實際應用中具有可操作性。

2.3 樺木醇的重結晶方法比較

由表4可知，甲醇—氯仿重結晶法得到的白色針狀固體為0.04 g，重結晶率為 8%。大孔吸附樹脂層析法得到的奶白色固體粉末為0.19 g，重結晶率為38%。無水乙醇重結晶法得到的白色粉末狀固體為0.40 g。重結晶率為80%。

表4 樺木醇初提物重結晶的產量及產率Table 4 Yield and yield of recrystallization of the initial extract of betulin

2.4 樣品中樺木醇鑒定

采用LC-MS方法對所提取的樺木醇樣品進行檢測，結果見圖3。

由圖3可知，樺木醇樣品色譜出峰時間為6.12 min，峰面積為749，與其他成分所形成的峰完全分離，通過與樺木醇標品對比可知，樣品中含有目標物樺木醇。

圖3 樺木醇樣品LC-MS檢測圖Figure 3 LC-MS detection of betulin samples

2.5 樺木醇的抗氧化活性

2.5.1 DPPH自由基清除能力 由圖4可知，當樺木醇溶液質量濃度為0.2～0.6 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除率逐漸增加，當樺木醇溶液質量濃度>0.6 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除效果不再顯著提升。與維生素C對DPPH自由基的清除能力相比而言，樺木醇溶液同樣也表現出了較強的清除效果。

圖4 樺木醇對DPPH自由基的清除作用Figure 4 DPPH radical scavenging effect of betulin

2.5.2 羥基自由基清除能力 由圖5可知，當樺木醇溶液質量濃度為0.2 mg/mL時，其對羥基自由基無清除效果，但隨著樺木醇質量濃度的增大，其對羥基自由基的清除作用逐漸增強。樺木醇的抗氧化性可能是樺木醇與自由基相結合，阻止了自由基的鏈式氧化反應。

圖5 樺木醇對羥基自由基的清除作用Figure 5 Hydroxyl radical scavenging effect of betulin

2.5.3 總還原力 由圖6可知，隨著樺木醇質量濃度的增加，溶液的吸光度值逐漸上升，但上升趨勢較為緩慢。在試驗質量濃度范圍內，維生素C的總還原能力強于樺木醇。

圖6 樺木醇的總還原力Figure 6 Results of total reducing power of betulin

3 結論

白樺樹皮中樺木醇的最佳提取工藝為乙醇體積分數80%、料液比1∶30 (g/mL)、提取溫度95 ℃、提取時間1.5 h，在此條件下樺木醇提取率為66.21%。以無水乙醇為溶劑進行重結晶，V無水乙醇∶m固體=30∶1 (mL/g)，-20 ℃重結晶，重結晶產率可達80.00%，最高純度達99.81%。抗氧化試驗表明，樺木醇具有較強的總抗氧化活性，但總還原能力及對羥基自由基、DPPH自由基清除能力均低于維生素C。后續可進一步探究混合溶劑重結晶對樺木醇純度的影響，同時從生物活性角度，探究其體內抗氧化活性及抗衰老能力，并對其作用機制進行深入研究。